Флуоресцентные репортеры и их репортажи. Научная электронная библиотека Спектральные свойства и характеристики хромофоров
Электронная спектроскопия
в супрамолекулярной химии
Основные разделы:
Физические основы поглощения света и фотолюминесценции
Техника измерения электронных спектров поглощения и люминесценции
Современные методы обработки спектроскопических данных
Примеры применения электронной спектроскопии для исследования свойств супрамолекулярных систем
Экспериментальные методы химии высоких энергий: Учебное пособие / Под общ. ред. М. Я. Мельникова. – М.: Изд-во МГУ, 2009. – 824 с
(ISBN 978-5-211-05561-2).
Е.Н. Ушаков / Самосборка и фотохимия супрамолекулярных систем на основе краунсодержащих непредельных соединений // дисс. док. хим. наук, ИПХФ РАН, Черноголовка, 2006. – 263 с.
Дополнительная литература:
E.N. Ushakov et al , Sandwich-type complexes of alkaline-earth metal cations with a bisstyryl dye containing two crown ether units, J. Phys. Chem. A, 1999, vol. 103, p. 11188-11193.
(имеется в электронном виде, PDF-файл, [email protected] )
I. Физические основы поглощения света и фотолюминесценции
Взаимодействие света с веществом
Свет, как известно, характеризуется длиной волны и частотой , которые связаны соотношением
где с – скорость света в вакууме, n – показатель преломления среды.
Волновую теорию света используют для интерпретации таких явлений как отражение, преломление, дифракция света, т.е. явлений, при которых свет не поглощается средой.
Однако для описания поглощения и испускания света веществом необходимо использовать квантовую теорию, согласно которой световая энергия может поглощаться только определенными порциями, или квантами. Энергия, переносимая одним квантом света, или, другими словами, фотоном, определяется уравнением Планка:
где h – постоянная Планка. То есть, монохроматический свет характеризуется не только длиной волны, но также и энергией фотона.
Поглощение монохроматического света гомогенной средой, содержащей поглощающее свет вещество, подчиняется закону ЛамбертаБера:
где I 0 – энергия монохроматического света, падающего за единицу времени на поверхность слоя вещества; I – энергия, прошедшая через слой вещества за единицу времени; l – толщина слоя, см; C – концентрация поглощающего свет вещества, моль/л; – молярный коэффициент поглощения (экстинкция), л/(мольсм), который зависит от природы вещества, длины волны света и температуры.
В фотохимии для характеристики поглощения обычно используют понятие оптическая плотность раствора (D , безразмерная величина)
Закон ЛамбертаБера не выполняется в тех случаях, когда значительная доля молекул переходит в возбужденное состояние (например, при очень высокой интенсивности падающего света). Отклонения от закона ЛамбертаБера иногда наблюдаются и при низких интенсивностях света. Однако эти отклонения являются кажущимися; как правило, они связаны либо с недостаточной разрешающей способностью спектрометра, либо с такими явлениями как ассоциация молекул.
Возбужденные электронные состояния
Используя слово свет, мы обычно подразумеваем оптическое излучение, видимое человеческим глазом. Спектральная кривая чувствительности человеческого глаза лежит в диапазоне 400 £ l £ 750 нм. Максимум чувствительности находится около 555 нм (зеленый свет). Для фотохимии интерес представляет более широкая область излучения, которую формально можно разделить следующим образом:
ближнее ультрафиолетовое (200 £ l £ 400 нм )
видимое (400 £ l £ 750 нм)
ближнее инфракрасное излучение (750 £ l £ 1000 нм)
При поглощении кванта света с l = 200–1000 нм возбуждаются внешние электроны молекулы, осуществляющие химическую связь; их возбуждение может приводить к химическому превращению. Этот спектральный диапазон является основным для спектроскопии поглощения и испускания света.
Спектры поглощения
Спектр поглощения вещества обычно состоит из полос разной интенсивности и ширины. Происхождение этих полос можно проиллюстрировать с помощью энергетической диаграммы молекулярных орбиталей (МО). Электроны в молекуле в основном состоянии располагаются парами на МО с разной энергией. Длинноволновая полоса в электронном спектре поглощения обычно соответствует переходу электрона с верхней занятой МО (ВЗМО) на нижнюю вакантную МО (НВМО). Полосы поглощения с большей энергией соответствуют переходам на вышележащие вакантные МО (например, S 0 S 2) или переходам с нижележащих занятых МО (например, S –1 S 1).
Структура и форма полосы поглощения
Полосы в спектрах поглощения нередко имеют определенную структуру. Это связано с тем, что каждому электронному состоянию соответствует набор разных колебательных состояний. На рисунке показана зависимость потенциальной энергии двухатомной молекулы в основном электронном состоянии от межъядерного расстояния (кривая S 0 ). Максимумы на кривых для колебательных состояний ( = 0, 1, 2, 3, 4) отвечают наиболее вероятным межъядерным расстояниям. Для нулевого колебательного состояния = 0 наиболее вероятное межъядерное расстояние находится в области минимума кривой потенциальной энергии. Для более высоких колебательных уровней наиболее вероятные межъядерные расстояния находятся вблизи точки поворота колебания. | ||
Принцип Франка Кондона Для объяснения относительной интенсивности переходов между колебательными уровнями основного и возбужденного электронных состояний используют принцип ФранкаКондона. Этот принцип основан на том, что электронный переход является намного более быстрым процессом (~10 15 с), чем движение ядер в молекуле (~10 13 с), то есть за время электронного перехода взаимное расположение ядер и их импульсы практически не изменяются. Поэтому электронно-колебательные переходы можно представить вертикальными линиями, соединяющими поверхности потенциальной энергии основного S 0 и возбужденного S 1 электронных состояний. Большинство молекул при комнатной температуре находится на нулевом колебательном уровне, поэтому фотоиндуцированные электронные переходы происходят именно с этого уровня. При данном расположении потенциальных кривых S 0 и S 1 наиболее вероятным электронно-колебательным переходом будет (0 2 )-переход. Интенсивность (0 0 )-перехода сравнительно мала, поскольку этому переходу соответствует маловероятное межъядерное расстояние. |
В многоатомной молекуле кривая потенциальной энергии переходит в многомерную поверхность, поэтому одному электронному переходу соответствует множество колебательных переходов. Часто эти колебательные переходы близки по энергии и им соответствует одна общая широкая полоса поглощения. Форма этой полосы, тем не менее, определяется принципом Франка-Кондона.
Процессы релаксации в электронно-возбужденных состояниях.
В жидких растворах при комнатной температуре электронно-возбужденные состояния молекул подвергаются сравнительно быстрым процессам релаксации электронно-колебательной энергии. Основные процессы релаксации: внутренняя конверсия из верхних возбужденных состояний S n в нижнее возбужденное состояние S 1 (< 10 12 с) и колебательная релаксация в состоянии S 1 , т.е. диссипация избыточной энергии колебаний в среде за счет столкновений возбужденных молекул вещества с молекулами среды (~10 11 с).
Эти процессы, как правило, происходят существенно быстрее по сравнению с процессом спонтанного испускания фотона, т.е. излучательной дезактивацией возбужденного состояния S 1 (~10 9 с). Поэтому излучательный переход из состояния S 1 в основное состояние S 0 , называемый флуоресценцией , происходит, как правило, из нулевого колебательного состояния. Таким образом, общим переходом при поглощении и испускании света является переход между нулевыми колебательными уровнями основного и возбужденного состояний, который называют (0 0 )-переходом. Энергия (0 0 )-перехода наименьшая при поглощении и наибольшая при испускании. Состояния S 0 и S 1 обычно имеют аналогичные распределения колебательных уровней по энергиям, поэтому спектр флуоресценции, как правило, близок к зеркальному отражению спектра поглощения, если оба спектра представлены в шкале энергии фотона. |
Стоксов сдвиг
Для сложных молекул в жидкой фазе (0 0 )-переход в спектре флуоресценции имеет меньшую энергию, чем (0 0 )-переход в спектре поглощения. Это связано с тем, что сразу после поглощения или испускания фотона молекула оказывается в неравновесном состоянии сольватации. В невязких растворителях при комнатной температуре переход возбужденного флуорофора в равновесное состояние сольватации происходит до испускания фотона. Поэтому (0 0 )-переход при испускании света имеет меньшую частоту, чем (0 0 )-переход при поглощении. Смещение полосы флуоресценции в красную область относительно длинноволновой полосы поглощения называется стоксовым сдвигом .
Мультиплетность
Мультиплетность электронного состояния равна n + 1, где n – число неспаренных электронов. Молекулярные орбитали молекул с четным числом электронов заполнены парами электронов с противоположно направленными спинами. Мультиплетность основного состояния большинства молекул с четным числом электронов равна 1, т.е. это синглетные состояния . При переходе электрона на верхнюю орбиталь его спин может оказаться ориентированным в том же или в противоположном направлении относительно оставшегося на нижней орбитали электрона. Если ориентации спина сохраняется, то мультиплетность возбужденного состояния, как и основного состояния, будет синглетным. Если же возбуждаемый электрон меняет направление спина, возбужденное состояние будет триплетным . Таким образом, одному основному состоянию соответствуют разные возбужденные состояния – синглетные и триплетные.
Диаграмма Яблонского
Физические процессы, протекающие в электронно-возбужденном состоянии молекул, принято представлять в виде диаграммы Яблонского. Основными безызлучательными процессами дезактивации нижнего возбужденного состояния S 1 являются внутренняя конверсия (переход между состояниями одинаковой мультиплетности) и интеркомбинационная конверсия (переход между состояниями разной мультиплетности, например, синглет-триплетный переход S 1 T 1 ). Внутренняя конверсия S 1 S 0 – сравнительно медленный процесс. Поэтому в возбужденном состоянии S 1 могут наблюдаться процессы спонтанного испускания фотона (спонтанное излучение) и фотохимические реакции. Излучательными процессами являются разрешенная по спину флуоресценция и запрещенная по спину фосфоресценция.
Классификация электронных переходов
Электронные спектры поглощения в УФ и видимом диапазонах, дают важную информацию о структуре и свойствах электронно-возбужденных состояний молекул. Знание спектра поглощения вещества является обязательным условием фотолюминесцентных и фотохимических исследований. Кратко остановимся на классификации электронных переходов
Электроны в органической молекуле располагаются на молекулярных -, - и n -орбиталях. На каждой молекулярной орбитали помещаются два электрона, отличающихся спинами. При возбуждении молекулы светом происходит переход электрона с занятой связывающей орбитали на свободную разрыхляющую орбиталь. Такие переходы обозначают в соответствии с их орбитальной природой: *, n *, * и n *.
Полосы поглощения, обусловленные переходами * , находятся преимущественно в вакуумной УФ области < 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.
Переходам n * соответствуют полосы поглощения в УФ области. Например, органические соединения, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталяхгетероатомов, О, N, S, поглощают УФ свет в области около 200 нм.
П ереходам * и n * соответствуют полосы поглощения в средней УФ-области. При сопряжении кратных связей полосы, обусловленные этими переходами, смещаются в ближнюю УФ- и видимую область спектра. Переходы n * характерны для соединений, содержащих такие хромофорные группы, как С=О, C=S, N=N; эти переходы часто оказываются запрещенными, и соответствующие им полосы поглощения имеют сравнительно низкую интенсивность.
Эта классификация пригодна в основном для относительно простых молекул. В сложных молекулах определенный вклад в электронный переход могут вносить электроны, находящиеся на орбиталях разного типа.
Значительный интерес представляют электронные переходы с переносом заряда. Если в молекуле имеются электронодонорная и акцепторная группы, и они находятся в -электронном сопряжении, то переход S 0 S 1 может сопровождаться переносом заряда от донора к акцептору по цепи сопряжения, как например, в данном стириловом красителе:
В этом случае говорят об электронном переходе с внутренним переносом заряда . Соответствующие полосы поглощения обычно характеризуются высокой интенсивностью и располагаются в видимой, а иногда и в ближней ИК области.
Для слабосвязанных органических донорно-акцепторных комплексов могут наблюдаться полосы поглощения, относящиеся к электронному переходу с переносом заряда от донора к акцептору через пространство (межмолекулярный перенос заряда ). Такие комплексы часто называют комплексами с переносом заряда. Длинноволновые полосы поглощения таких комплексов имеют сравнительно низкую интенсивность и могут находиться в ближней УФ, видимой и ближней ИК области спектра.
В металлорганической химии различают полосы поглощения, соответствующие переносу заряда от лиганда к металлу (ПЗЛМ ) и от металла к лиганду (ПЗМЛ ).
Е. О. Пучков,
доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
«Химия и жизнь» №9, 2014
Сразу две статьи этого номера «Химии и жизни» рассказывают о свечении биообъектов. На фото слева - малощетинковый червь Fridericia heliota , открытый учеными из Красноярского университета. О том, как был исследован его люциферин - вещество, которое при окислении ферментом люциферазой испускает голубоватый свет, - читайте в статье «Огоньки под ногами» . На фото справа - синтетический люциферин фридериции в присутствии АТФ и других необходимых компонентов демонстрирует такое же свечение, как и белковый экстракт червя. Это подтверждает, что структура люциферина установлена верно.
В отличие от флуоресцентных микроскопов, проточные цитометры не дают возможности полюбоваться флуоресцирующими объектами. Их сильная сторона - скорость регистрации сигналов от единичных объектов, например от клеток в суспензии. Обычный коммерчески доступный цитометр работает со скоростью 1000 клеток в секунду, а специализированные высокопроизводительные - до 25 000 клеток в секунду! В стандартном варианте у каждого объекта измеряются от двух до десяти параметров: светорассеяния и флуоресценции одного или нескольких флуорофоров. Таким образом можно получить статистически достоверные результаты по гетерогенности клеточных, в частности микробных, популяций. Существуют также приборы, способные сортировать клетки по определенным параметрам светорассеяния или флуоресценции, чтобы затем изучать субпопуляции с использованием других методов.
...И что из них можно узнать
Итак, все флуоресцентные репортеры имеют специализацию, то есть способны избирательно характеризовать определенные свойства биологической системы. Остановимся вкратце на некоторых категориях «специалистов».
С помощью ряда флуоресцентных репортеров (как правило, органических флуорофоров) можно следить за ферментативным катализом - исследовать динамику ферментативных реакций, их локализацию в клетках, тканях, органах и т. п. Это, например, субстраты с ковалентно присоединенными флуорофорами, которые начинают флуоресцировать только после высвобождения в ходе реакции, или «профлуорофоры», становящиеся флуоресцентными при взаимодействии с продуктом реакции.
Репортеры, сформированные на основе антител - физические комплексы или ковалентные соединения флуорофоров с антителами, - информируют о протекании иммунологических реакций. Флуоресцирующим компонентом может быть любой из известных органических и неорганических флуорофоров, включая квантовые точки. Кроме того, к антителам можно присоединять ферменты, катализирующие реакции с образованием флуоресцирующего продукта. Современные технологии позволяют получить антитела к любому белку (антигену), интересующему исследователя, антитело же с флуоресцентной меткой заставит светиться этот белок или структуру, из него построенную. Например, с помощью флуоресцентных антител выявлены микрофибриллы в фибробластах мышей (см. фото на второй странице обложки).
Очень информативны методы с использованием флуоресцентных белков (ФБ). Мы уже упоминали о том, как полезны методы внедрения в клетку генов гибридных белков, которые заставляют флуоресцировать естественный белок или даже нуклеиновую кислоту. Вдобавок флуоресценция ФБ-содержащих гибридных белков зависит от кислотности среды, что позволяет измерять рН не только внутри клетки, но и внутри отдельных органелл, если такой белок «адресован» в ядро или митохондрию.
Особый интерес вызывает применение ФБ в сочетании с методиками измерения флуоресценции, основанными на безызлучательной передаче энергии. Представьте себе два гибридных белка, один из которых заставляет флуоресцировать другой при сближении. Подобным же образом можно изучать конформационные (структурные) изменения в белках, если присоединить ФБ к разным участкам одной белковой молекулы.
Чувствительность флуоресценции к физическим свойствам микроокружения флуорофоров позволяет использовать некоторых из них в качестве репортеров различных параметров внутриклеточной среды. В их числе, например, вязкость цитоплазмы, внутреннего содержимого органелл, гидрофобного слоя биомембран. Взаимодействие некоторых флуорофоров с биологическими мембранами зависит от разности электрических потенциалов на мембране: с помощью таких репортеров получают сведения о величине мембранного потенциала. Существуют даже репортеры для измерения внутриклеточной температуры!
Не только на глаз
Возможности зрительного анализа ограничены в основном качественной оценкой: «есть свечение - нет свечения». Гораздо больше информации дают количественные характеристики (см. главу «Язык флуоресцентных репортеров»).
Для количественной характеристики флуоресценции используют две методологии. Первая служит для измерения различных характеристик флуоресценции в сравнительно большой (макроскопической) области объекта, что обеспечивает получение усредненных характеристик по объекту: раствору, суспензии коллоидных частиц, клеток, субклеточных частиц и т. п. Вторая ориентирована на единичные микроскопические объекты, в первую очередь клетки и субклеточные частицы.
Измерения интегральной флуоресценции проводят с помощью спектрофлуориметров (флуоресцентных спектрофотометров) и планшетных флуориметров (англ. plate readers ). Спектрофлуориметры-это, как правило, аналитические приборы, на которых можно получить все основные характеристики флуоресценции. Планшетные флуориметры - устройства для анализа большого количества образцов (иногда более тысяч), но лишь по нескольким фиксированным характеристикам, например по интенсивности флуоресценции в определенной спектральной области и/ или по времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии. Большинство методик с использованием планшетных флуориметров основано на иммунологических реакциях или на анализе развития культур клеток в монослоях.
Методология измерений флуоресценции единичных микроскопических объектов также имеет два варианта.
Первый основан на получении цифровых изображений объектов с последующим компьютерным анализом. Второй - на «поштучном» измерении флуоресценции микрообъектов в потоке, при прохождении через узкий капилляр специального прибора - проточного цитометра.
Флуоресцентная микроскопия недавно пережила настоящую революцию: разработаны новые устройства, прежде всего конфокальные микроскопы, в которых возбуждение и регистрация флуоресценции осуществляются через микроскопическое отверстие, отсекающее «лишнее» свечение, которое возникает вне фокуса объектива. Этот «зрачок» сканирует изображение в горизонтальной и/или вертикальной плоскости, сигналы регистрирует фотоумножитель, и после их компьютерной обработки получается пространственное изображение объекта. Такая конструкция позволяет получать более четкие по сравнению со стандартными микроскопами двумерные и трехмерные изображения. Кроме того, на современных конфокальных микроскопах можно проводить измерения параметров затухания флуоресценции.
Еще один тип «революционных» микроскопов функционирует, казалось бы, вопреки основным физическим принципам флуоресценции. Атомы в них возбуждаются светом с длиной волны, большей, чем у флуоресценции, а не меньшей. На самом деле никакие законы физики при работе этих микроскопов не нарушаются, просто при достаточной интенсивности светового потока с большей длиной волны в один и тот же атом одновременно могут попасть два фотона, поглощенная электронами энергия удваивается, и ее оказывается достаточно для возбуждения флуоресценции. Поэтому такие микроскопы называются двухфотонными. А поскольку световой поток максимально сконцентрирован в фокусе объектива, обеспечивается условие высокого разрешения изображений. Двухфотонные микроскопы отличает также способность регистрировать флуоресценцию в образцах на глубине до 1,5 мм и возможность существенно уменьшить неблагоприятное действие возбуждающего излучения как на исследуемые объекты, так и на флуоресцентные репортеры.
Количественную информацию из цифровых изображений извлекают с помощью компьютерных программ анализа изображений. Измеряют интенсивность флуоресценции и ее пространственное распределение, оценивают спектральные характеристики излучения, определяют количество флуоресцирующих частиц, например клеток, характеризуют временные и поляризационные параметры флуоресценции. Специальные аналитические приемы (так называемая флуоресцентная корреляционная спектроскопия) позволяют использовать конфокальную и двухфотонную микроскопию для исследования движения даже единичных флуоресцирующих молекул!
Что высветили в микромире флуоресцентные репортеры
Флуоресцентные репортеры долго и успешно служат во многих, если не во всех областях экспериментальной биологии. Однако есть такие области, где они сыграли ключевую роль.
С использованием флуоресцентных репортеров была экспериментально доказана модель жидкокристаллической структуры всех биологических мембран. Согласно этой модели, при всей ее структурной целостности мембрана достаточно «жидкая», чтобы отдельные ее компоненты могли перемещаться в нужные стороны. Такое представление позволяет понять основные молекулярные механизмы функционирования мембран, а также свойства живых клеток в целом.
В значительной мере благодаря информации от флуоресцентных репортеров прояснились механизмы трансформации энергии в клетках. Особую роль здесь сыграли флуорофоры, позволяющие регистрировать внутриклеточный и внутримитохондриальный рН, а также разность электрических потенциалов на мембранах. С их помощью прежде всего был выявлен механизм сопряжения энергодонорных реакций окисления с энергозатратным синтезом аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального поставщика энергии для большинства метаболических процессов. Кроме того, была изучена природа накопления различных веществ в цитоплазме и в клеточных органеллах за счет мембранного электрического потенциала и градиента рН.
Жизнедеятельность клеток обеспечивается совокупностью скоординированных в пространстве и времени биохимических реакций, а за координацию отвечают так называемые сигнальные системы. Основные компоненты этих систем были изолированы и охарактеризованы с помощью методов традиционной биохимии и молекулярной биологии. Однако только подходы, основанные на применении флуоресцентных репортеров, показали напрямую, где пролегают эти пути и как по ним проходят сигналы, - стало возможным в реальном времени следить за взаимодействиями сигнальных белков или оценивать динамику экспрессии генов в отдельно взятой клетке. С помощью флуоресцентных репортеров удалось обнаружить и неизвестные ранее сигнальные компоненты, например выявить роль ионов Са +2 как сигнального посредника во многих регуляторных реакциях.
Во второй половине ХХ века в микробиологии возникла проблема, которую окрестили «великой аномалией учета микроорганизмов с помощью чашек Петри». «Виновниками» оказались флуоресцентные репортеры, два красителя нуклеиновых кислот - акридиновый оранжевый и 4,6-диамидино-2-фенилиндол. Оценить содержание микроорганизмов в природном образце можно, либо подсчитывая колонии, выросшие на чашке Петри (при достаточном разведении «посевного материала» каждую колонию образуют потомки лишь одной клетки), либо напрямую подсчитывая под микроскопом сами микроорганизмы, прокрашенные флуоресцентными красителями нуклеиновых кислот. Так вот, флуоресцентные репортеры всегда выявляли значительно больше микроорганизмов, чем анализ с чашками Петри.
Для объяснения этого противоречия были выдвинуты две гипотезы. Согласно первой, часть клеток, находящихся в состоянии покоя, не размножается на чашках Петри. Согласно второй, условия культивирования (состав среды, температура и др.) не соответствуют потребностям некоторой части популяции. Проверка этих гипотез показала, что возможно и то, и другое. Более того, был дан толчок к формированию двух новых больших направлений исследований. Первое связано с изучением так называемого жизнеспособного, но некультивируемого состояния микроорганизмов. Понятна практическая значимость таких исследований: например, патогены человека в этом состоянии могут быть невидимы для стандартных методов диагностики и более устойчивы к лекарственным препаратам. Второе направление - выявление и изучение микроорганизмов в природных образцах путем прямого анализа их нуклеиновых кислот, без предварительного получения чистых культур, как это делалось раньше. Это направление получило собственное название - метагеномика. Благодаря методам метагеномики (кстати, некоторые из этих методов предполагают использование флуоресцентных репортеров) появилась возможность по-новому увидеть биологическое разнообразие микроорганизмов в отдельных экосистемах и на Земле в целом.
Итак, современные флуоресцентные репортеры - это огромная армия специалистов, и многие из них уже имеют громкую славу в экспериментальной биологии. Их репортажи позволили лучше разглядеть те уголки микромира, куда может заглянуть свет. Однако многие исследователи, работающие в данной области, считают, что все, увиденное нами в свете флуоресценции до сих пор, - это только начало!
Классификация электронных переходов
Диаграмма Яблонского
Физические процессы, протекающие в электронно-возбужденном состоянии молекул, принято представлять в виде диаграммы Яблонского. Основными безызлучательными процессами дезактивации нижнего возбужденного состояния S 1 являются внутренняя конверсия (переход между состояниями одинаковой мультиплетности) и интеркомбинационная конверсия (переход между состояниями разной мультиплетности, например, синглет-триплетный переход S 1 ®T 1 ). Внутренняя конверсия S 1 ®S 0 – сравнительно медленный процесс. Поэтому в возбужденном состоянии S 1 могут наблюдаться процессы спонтанного испускания фотона (спонтанное излучение) и фотохимические реакции. Излучательными процессами являются разрешенная по спину флуоресценция и запрещенная по спину фосфоресценция.
Электронные спектры поглощения в УФ и видимом диапазонах, дают важную информацию о структуре и свойствах электронно-возбужденных состояний молекул. Знание спектра поглощения вещества является обязательным условием фотолюминесцентных и фотохимических исследований. Кратко остановимся на классификации электронных переходов
Электроны в органической молекуле располагаются на молекулярных s-, p- и n -орбиталях. На каждой молекулярной орбитали помещаются два электрона, отличающихся спинами. При возбуждении молекулы светом происходит переход электрона с занятой связывающей орбитали на свободную разрыхляющую орбиталь. Такие переходы обозначают в соответствии с их орбитальной природой: s-s*, n -s*, p-p* и n -p*.
Полосы поглощения, обусловленные переходами s®s* , находятся преимущественно в вакуумной УФ области < 200 нм, где обычные спектрофотометры не применимы.
Переходам n -s* соответствуют полосы поглощения в УФ области. Например, органические соединения, содержащие n -электроны, локализованные на орбиталях гетероатомов, О, N, S, поглощают УФ свет в области около 200 нм.
Переходам p®p* и n ®p* соответствуют полосы поглощения в средней УФ-области. При сопряжении кратных связей полосы, обусловленные этими переходами, смещаются в ближнюю УФ- и видимую область спектра. Переходы n ®p* характерны для соединений, содержащих такие хромофорные группы, как С=О, C=S, N=N; эти переходы часто оказываются запрещенными, и соответствующие им полосы поглощения имеют сравнительно низкую интенсивность.
Эта классификация пригодна в основном для относительно простых молекул. В сложных молекулах определенный вклад в электронный переход могут вносить электроны, находящиеся на орбиталях разного типа.
Значительный интерес представляют электронные переходы с переносом заряда. Если в молекуле имеются электронодонорная и акцепторная группы, и они находятся в p-электронном сопряжении, то переход S 0 ®S 1 может сопровождаться переносом заряда от донора к акцептору по цепи сопряжения, как например, в данном стириловом красителе:
В этом случае говорят об электронном переходе с внутренним переносом заряда . Соответствующие полосы поглощения обычно характеризуются высокой интенсивностью и располагаются в видимой, а иногда и в ближней ИК области.
Для слабосвязанных органических донорно-акцепторных комплексов могут наблюдаться полосы поглощения, относящиеся к электронному переходу с переносом заряда от донора к акцептору через пространство (межмолекулярный перенос заряда ). Такие комплексы часто называют комплексами с переносом заряда. Длинноволновые полосы поглощения таких комплексов имеют сравнительно низкую интенсивность и могут находиться в ближней УФ, видимой и ближней ИК области спектра.
В металлорганической химии различают полосы поглощения, соответствующие переносу заряда от лиганда к металлу (ПЗЛМ ) и от металла к лиганду (ПЗМЛ ).
Федеральное
агентство морского
и речного транспорта
РФ
МОРСКОЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ
имени
адмирала Г.И. Невельского
Морского физико-технического института
Курсовая работа по флуоресценции
Выполнил: Демиденко А. А.,
-
студент 20.31 группы
- Руководитель:
Майор А. Ю.
2010
Оглавление.
- Введение.
Глава 1 – основы спектроскопии.
- Диаграмма
Яблонского.
Характеристики испускания флуоресценции.
Стоксов сдвиг.
Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения.
Правило зеркальной симметрии.
- Фото - электронный
умножитель.
Электронно - оптический преобразователь.
Приборы с зарядовой связью.
- Металл - окисел
- полупроводник (МОП-ёмкость).
Зарядовая связь.
Сдвиговый регистр с зарядовой связью.
Фоточувствительные приборы с зарядовой связью (ФПЗС).
- Проточный
лазерный флуориметр.
Малогабаритный ЛИФ спектрометр.
Список используемой литературы.
Введение
Решение
проблем окружающей среды и рационального
использования природных ресурсов
во многом зависит от разработки и
внедрения методов дистанционного
экспресс-анализа малых примесей
в атмосфере и воде. В естественных
водных средах такими примесями являются
биологическая связь, растворенные органические
и минеральные вещества, многочисленные
загрязнители. Большими возможностями
в анализе примесей располагает лазерная
спектроскопия, использующая комбинационное
рассеивание света, флуоресцентный анализ.
В
настоящее время для оперативного
мониторинга водных экосистем широко
применяют оптические методы позволяющие
определять концентрацию фитопланктона
и других веществ. Наибольшее распространение
получили спектральные методы. Особенно
актуальными такие исследования стали
после выявления прямой зависимости биологической
продуктивности морей и океана от содержания
в воде фитопланктона.
Определение
концентрации фитопланктона по оптическим
характеристикам морской среды может
выполняться пассивными и активными методами.
Первый широко используют с применением
авиа- и спутниковых носителей. Эти методы
основаны на измерении яркости отражаемой
от поверхности воды солнечной энергии
в широком диапазоне длин волн. Они позволяют
собирать масштабные данные о поверхности
водной среды, но имеют существенные ограничения:
малое пространственное разрешение и
невозможность измерения глубинных профилей.
Использование пассивных методов ограничивается
их не высокой точностью, что обусловлено
сильным влиянием состояния атмосферы
в месте проведения измерений.
Активные
методы основаны на облучении воды лазерным
лучом и регистрации спектра флуоресценции.
Различают лидарные, прокачиваемые и погружные
флуориметры. Самыми оптимальными
являются проточные флуориметры, которые
обладают высокой точностью и большим
пространственным разрешением.
Глава: 1
Основы
спектроскопии.
Люминесценция-
испускание фотонов из электронно-возбужденных
состояний – делится на два типа в зависимости
от природы основного и возбужденного
состояния. В синглетном возбужденном
состоянии электрон на энергетически
более высокой орбитали и второй электрон
на орбитали с более низкой энергией имеют
противоположную ориентацию спинов. Говорят,
что эти электроны спарены. В триплетном
состоянии эти электроны не спарены, т.е.
их спины имеют одинаковую ориентацию.
При возвращении электрона из возбужденного
сингнетного состояния в основное ориентация
его спина не должна меняться. Изменение
ориентации спина необходимо при переходе
из триплетного состояния в синглетное
основное состояние.
Флуоресценция-
это испускание, происходящее при
возвращении спаренного электрона
на более низкую орбиталь. Такие переходы
квантовомеханически “разрешимы”, а
типичные величины скоростей испускания
для них~10 8 с -1 . Высокие значения
скорости испускания приводят к временам
затухания флуоресценции 10 8 с(10 нс).
Время жизни- это средний период времени,
в течение которого флуорофор находится
в возбужденном состоянии. Фосфоресценция-
это испускание, происходящее при переходе
между состояниями различной мультиплетности,
как правило из возбужденного триплетного
состояния в синглетное основное. Такие
переходы не разрешены, и константы скорости
испускания малы. Типичный диапазон времени
затухания фосфоресценции - от миллисекунд
до секунд, что главным образом зависит
от вклада других процессов дезактивации.
Флуоресцентные
спектральные данные обычно представляют
в виде спектров испускания. Спектр испускания
флуоресценции - это зависимость интенсивности
флуоресценции от длин волн (в нанометрах)
или волновых чисел (в см -1). Два типичных
спектра испускания флуоресценции приведены.
Спектры испускания сильно изменяются
и зависят как от химической структуры
флуорофора, так и от растворителя, в котором
флуорофор рас творен. Спектры некоторых
соединений, таких, как перилен, имеют
четкую структуры, обусловленную отдельными
колебательными уровнями энергии основного
и возбужденного состояний. Другие состояния,
такие, как хинин, имеют спектры без колебательной
структуры.
1.1.
Диаграмма Яблонского
Поглощение и испускание света хорошо
иллюстрирует диаграмма уровней энергии,
предложенная Яблонским. Основное, первое
и второе электронные состояния обозначают
S 0 ; S 1 ; S 2
соответственно (рис. 1.а). Каждый из этих
уровней энергии может состоять из множества
колебательных энергетических уровней,
обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между
различными электронными уровнями обозначены
вертикальными линиями. Такое представление
используется, чтобы наглядно
РИС.1.а
Диаграмма Яблонского.
Рис. 1.б Диаграмма Яблонского.
Показать
мгновенную природу поглощения света.
Этот процесс происхо-дит примерно за
10 -18 с, время, слишком короткое для
заметного смещения ядер(принцип Франка-
Кондона).
Энергетическая
щель между различными колебательными
уровнями энергии видна из спектра испускания
перилена. Относительное число молекул
перилена, находящихся в колебательных
состояниях 0 и 1, описывается распределением
Больцмана.
1.2 Характеристики испускания
флуоресценции
Для
явления флуоресценции известно
несколько основных характеристик.
Существуют и исключения, но они редки.
Если какая-либо из нижеперечисленных
характеристик отсутствует у данного
флуорофора, можно сделать вывод о некоторых
особых свойствах этого соединения.
1.3.
Стоксов сдвиг
Рис.
2. Источником ультрафиолетового возбуждения
служил солнечный свет, пропущенный через
пластинку из голубого стекла. Перед приемником
в качестве желтого фильтра стоял стакан
с вином. Флуоресценция хинина лежит в
области 450 нм и поэтому хорошо заметна
невооруженным глазом. В настоящее время
для определения величины стоксова сдвига
используют другие методы.
Потери
энергии между возбуждением и испусканием
неизменно наблюдаются для флуоресцирующих
молекул в растворах. Одной из основных
причин возникновения стоксова сдвига
является быстрая релаксация на нижний
колебательный уровень состояния S 1 .
К тому же обычно происходит переход
РИС. 2. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.
на возбужденные колебательные уровни состояния S 0 (см. рис. 1), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры к реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.
1.4. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения
Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния S 1 . Эта релаксации происходит за время порядка 10 -12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S 2 , так и из S 1 - состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.
1.5. Правило зеркальной симметрии
Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из S 0 в S 1 . Это особенно наглядно в случае перилена. Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состоянии S 0 и S 1 . Для многих молекул различное распределение электронов в состояниях S 0 и S 1 , существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без изменения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис 3).
РИС. 3 Правило зеркальной симметрии и факторы Франка-Кондона
Глава: 2
Технические составляющие.
2.1-Фото
Электронный Умножитель
Фотоэлектронным
умножителем называют электровакуумный
прибор, преобразующей энергию оптического
излучения в электрические сигналы и содержащий
фотокатод, вторично-электронный умножитель
и анод. От вакуумного фотоэлемента ФЭУ
отличается тем, что кроме фотокатода
и анода содержит ещё фокусирующую
электронно-оптическую систему, диафрагму
и дополнительные электроды (диноды), являющиеся
эмиттерами вторичных электронов. (рис.
4)
При освещении
фотокатод 1 эмитирует первичные
фотоэлектроны, которые ускоряются
электрическим полем и фокусируются
электронно-оптической системой 2 на первый
динод Э 1 , вызывая его увеличенную
вторичную электронную эмиссию. Вторичные
электроны, вылетевшие из первого динода,
ускоряются электрическим полем и направляются
на второй динод Э 2 , увеличенный
поток электронов со второго динода направляется
на третий и т.д.
Электрическое
поле, ускоряющее электроны, создаётся
делителем постоянного напряжения,
обеспечивающим больший положительный
потенциал каждого последующего каскада
относительно предыдущего R1 – R11 .
Пространство
образуемое поверхностями фотокатода
1 и первого динода Э 1 с расположенными
между ними электродами, котодной (входной)
камерой ФЭУ Форма и распределение
электрического потенциала на поверхности
фотокатода фокусирующего электрода 2
и диафрагмы 3 должны обеспечить максимальный
сбор фотоэлектронов на первый динод за
счёт использования законов движения
электронов электрическом поле. Качество
электронно-оптической системы катодной
камеры определяется коэффициентом сбора
электронов Y k (отношением числа
фотоэлектронов, достигших первого динода,
к общему числу эмитированных фотокатодом
электронов n k) . Коэффициент сбора электронов у современных
ФЭУ близок к единице.
Первичные
фотоэлектроны, попадая на первый
динод, взаимодействуют с электронами
его вещества и возбуждают
их до более высоких энергетических
состояний. Часть электронов перемещается
к границе динода с вакуумом. Электроды,
которые достигают поверхности с энергией,
превышающей поверхностный потенциальный
барьер, переходя в вакуум и ускоряются
электрическим полем в направлении ко
второму диноду.
Рис.4 Устройство
ФЭУ со схемой его питания
2.2-Электронно Оптический Преобразователь
Рис
5
1-входное
окно
2-Защитная
плёнка
3-
Микроканальная пластина (МКП)
4-Фосфорный
экран
5-выходное
окно
Принцип действия
хорошо иллюстрирует рис. 5. Попадая в канал,
электрон испытывает соударения со стенкой
и выбивает вторичные электроны. В тянущем
электрическом поле этот процесс многократно
повторяется, позволяя получить коэффициент
усиления Nх10 4
и т.д.................
Введение в флуоресценцию
Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний , В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что эти электроны спарены *. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция - это испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически "разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них ~10 8 с -1 . Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции~10 -8 с (10 нс). Время жизни - это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция - это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности **, как правило, из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции - от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации. В данной книге повсюду мы в первую очередь будем рассматривать более быстрый процесс флуоресценции.
В веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях.
*Правильнее было бы сказать, что спины этих электронов спарены. Спаренными обычно называют электроны, находящиеся на одной и той же орбитали, - Прим. Ред.
** Мультиплетностью состояния называют величину т= 2s + 1, где s - суммарный электронный спин данного состояния. Так, для синглетных состояний т= 1 и s = 0, для триплетных - т= 3 и s = 1 - Прим.ред.
Структуры некоторых типичных флуорофоров представлены на рис. 1.1. Одним из широко распространенных флуорофоров является хинин, который добавляют в тонизирующие напитки. Если посмотреть на стакан тоника, выставленного на солнечный свет , часто можно увидеть слабое голубое свечение. Оно наиболее заметно, если на стакан смотреть под прямым углом к направлению солнечного света, а также, если диэлектрическая постоянная уменьшена благодаря присутствию добавок. Хинин, возбуждаемый ультрафиолетовым излучением солнца, при возвращении в основное состояние испускает голубой свет с длиной волны около 450 нм. Явление флуоресценции часто может быть обусловлено некоторыми добавками. Например, зеленое или красно-оранжевое свечение, наблюдаемое иногда в антифризе, вероятно, вызвано следовыми количествами флуоресцеина или родамина соответственно (рис. 1.1). Многоядерные ароматические углеводороды, такие, как антрацен или перилен, также флуоресцируют, чем может частично определяться голубая флуоресценция бензина. И наконец, сильно флуоресцируют такие соединения, как РРО и РОРОР, используемые в "сцинтилляционных" растворах и биохимических исследованиях. Другие примеры будут даны в книге со ссылками на полезные свойства индивидуальных флуорофоров. В отличие от молекул органических ароматических соединений атомы* в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе.
РИС. 1.1. Структуры типичных флуоресцирующих соединений.
РИС. 1.2. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина (по данным ).
Спектры испускания не могут быть правильно изображены одновременно в шкале длин волн и в шкале волновых чисел. В данном случае использовано правильное изображение в шкале волновых чисел. Длины волн приведены для удобства (см. гл. 2).
Единственным заметным исключением является группа элементов, обычно называемых лантаноидами [ 1]. Флуоресценция ионов европия и тербия вызвана переходами электронов между f -орбиталями, которые экранированы от растворителя более высокими заполненными орбиталями.
Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см -1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис , 1.2. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, имеют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний *. Другие соединения, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры.
*Колебательная структура спектров испускания определяется колебательными подуровнями основного, а не возбужденного электронного состояния (подробнее см„ ниже). - Прим.. peд,
1.1. Диаграмма Яблонского
Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским [ 3], Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S 0 , S, и S 2 соответственно (рис. 1.3), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Влияние растворителя во внимание не принимается, оно будет подробнее рассмотрено в гл. 7. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется , чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10 -15 с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер (принцип Франка - Кондона).
Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.2). Отдельные максимумы испускания (а следовательно, и колебательные уровни энергии) отстоят друг от друга примерно на 1500 см -1 . Относительное число молекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описывается распределением Больцмана:
Отношение R числа молекул в двух состояниях с разностью энергий Е дается выражением
R = e - E/kT (1.1)
где k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура, К. При комнатной температуре 300 К отношение R равно~0,01. Следовательно, большинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном состоянии; именно такие молекулы и поглощают свет.
РИС. 1.3. Диаграмма Яблонского.
Из-за большой разности энергий между уровнями S 0 и S 1 по существу, ни у каких флуорофоров состояние S 1 не может быть заселено термическим путем. Интересно отметить, что даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах.
За поглощением света обычно следует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровня состояний (S 1 либо S 2). 3а некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация на самый нижний колебательный уровень состояния S 1 . Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10 -12 с. Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10 -8 с, внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденного состояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов на самый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденному состоянию (рис. 1.3). Термическое равновесие достигается за время порядка 10 -12 с. Интересным следствием из такого рассмотрения является то, что спектр поглощения молекулы отражает колебательную структуру возбужденных электронных состояний, а спектр испускания - колебательную структуру основного электронного состояния. В большинстве случаев электронное возбуждение не сильно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательные структуры, проявляющиеся в спектрах поглощения и испускания, сходны.
Молекулы в состоянии S 1 могут также подвергаться конверсии в первое триплетное состояние Т 1. Испускание из Т 1 называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из S 1 в Т 1 называется интеркомбинационной конверсией
. Переход из Т 1 в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.3: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях. Все они будут рассмотрены детально в последующих разделах книги.
1.2 Характеристики испускания флуоресценции
Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения,
1.2.1. Стоксов сдвиг
Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, т.е. потеря энергии (исключение - атомы в газовой фазе). Это явление впервые наблюдал Стоке в 1852 г. в Кембридже [ 4], используя при этом аппаратуру , принцип действия которой изображен на рис. 1.4. Источником ультрафиолетового возбуждения служил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Перед приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином, Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невооруженным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.
Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S 1 . К тому же обычно происходит переход на возбужденные колебательные уровни состояния S 0 (см. рис. 1.3), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии.
РИС. 1.4. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига.
Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.
1.2.2, Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения
Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния.S 1 . Эта релаксации происходит за время порядка 10 -12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S 2 -, так и из S 1 -состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров , которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.
1,2.1 Правило зеркальной симметрии
Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу изS 0 в S 1. Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.2). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний S 0 и S 1 . Для многих молекул различное распределение электронов в состояниях S 0 и S 1 существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без изменения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка - Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис. 1.5).
РИС. 1.5. Правило зеркальной симметрии и факторы Франка - Кондона.
Необходимым условием для зеркальной симметрии является представление спектров поглощения и испускания в соответствующих единицах. Наилучшая симметрия должна существовать между модифицированными спектрами (v)/v и F(v)/v 3 , где (v) - коэффициент поглощения, соответствующий волновому числу v, a F(v) - относительный поток фотонов в интервале волновых чисел Δ v [ 5]. Соответствие между такими спектрами обычно наблюдается для полиядерных ароматических углеводородов.
Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис. 1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила. В спектре испускания видна колебательная структура, которая отсутствует в спектре поглощения. Такое отклонение от правило зеркальной симметрии обычно указывает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.
РИС. 1.6. Спектры поглощения и испускания дифенила.
Смешение ядер может произойти до процесса испускания из-за относительно большого времени жизни состояния S 1 . В случае дифенила, вероятно, отдельные кольца становятся более копланарными в возбужденном состоянии, в результате чего спектр испускания становится более структурированным по сравнению со спектром поглощения. Дифенил не только представляет собой пример отклонения от правила зеркальной симметрии, он необычен еще и тем, что его спектр испускания имеет более четко выраженную колебательную структуру, чем спектр поглощения. Обычно наблюдается противоположная картина.
Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона (см, рис, 11,18). Величина рК а фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.
РИС. 1.7. Спектры испускания пирена и его эксимера (по данным ).
Относительная интенсивность в максимуме флуоресценции эксимера (470 нм) уменьшается при понижении концентрации пирена от 6x10 - 3 М (верхняя кривая) до 0,9x10 -1 М (нижняя кривая).
Вслед за возбуждением фенольный протон переходит к акцепторам протона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что, даже несмотря на отсутствие активных групп, многие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы , называемые эксимерами (сокращение от excited dimers - возбужденные димеры). Испускание эксимеров смешено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура (рис.1.7), Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с аминами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужденном состоянии, называют эксиплексами.
1.3. Времена затухания и квантовые выходы флуоресценции
Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений. Смысл этих параметров хорошо виден из модифицированной диаграммы Яблонского (рис. 1.8). На этой диаграмме мы не указываем подробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию S 1 , а обращаем большое внимание на процессы, которые ответственны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние S 0 (k).
Квантовый выход флуоресценции - это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Обе константы скорости Г и k соответствуют процессам уменьшения заселенности возбужденного состояния. Доля молекул флуорофора , которые дезактивируются с испусканием, а следовательно, и квантовый выход определяются выражением
Q = Г/(Г+k) (1.2)
Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испускания, т. е. k « Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Для удобства мы сгруппировали все возможные процессы безызлучательной дезактивации в одну константу скорости k.
РИС. 1.8. Модифицированная диаграмма Яблонского.
Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресценции -10 нс, Для флуорофора, описываемого диаграммой Яблонского (рис. 1.8), время затухания равно
τ = 1/(Г +k) (1.3)
Необходимо помнить, что испускание флуоресценции - это случайный про
цесс и не все молекулы испускают фотоны при t = τ. Время жизни - это
средняя продолжительность пребывания в возбужденном состоянии. В приме
ре для одноэкспоненциального затухания, приведенном в гл. 3, 63% молекул гибнет за время t = τ, а 37 % - за время t > τ. Время жизни флуорофора в отсутствие безызлучательных процессов, называемое собственным временем жизни *,τ 0 , равно
τ 0 = 1/Г (1.4)
Отсюда вытекает обычное соотношение между квантовым выходом и време
нем жизни:
Q= τ / τ 0 (1.5)
Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием любых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания. Сцинтилляторы обычно выбирают за их высокие квантовые выходы , которые являются результатом больших значений Г. Им обычно соответствуют короткие времена жизни, порядка 1 нс. Флуоресценция ароматических соединений, содержащих группы N0 2 , обычно слаба, в первую очередь из-за большой величины k. Переход триплет- синглет запрещен по симметрии, и константы скорости спонтанного испускания составляют ~10 3 с- 1 или меньше **. Поскольку значения k близки к 10 9 с- 1 , квантовые выходы фосфоресценции малы при комнатной температуре. Из уравнения (1.2) можно получить квантовые выходы фосфоресценции, равные 10 -6 .
*Правильнее называть его радиационным (излучательным) временем жизни. - Прим. ред.
**Автор приводит слишком большое значение k для внутримолекулярной безызлучательной дезактивации триплетных состояний, которая встречается редко - лишь для молекул, претерпевающих химические превращения (в частности, изомеризацию). Из-за спинового запрета безызлучательный интеркомбинационный переход Т 1 → S 0 для большинства молекул имеет константы скорости k 1.4. Анизотропия флуоресценции
Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны , электрические векторы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. Момент перехода имеет определенную ориентацию в молекуле флуорофора. В изотропных растворах молекулы флуорофоров ориентированы случайным образом. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те молекулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света (см. разд. 5.2.1). Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуорофоров (фотоселекция) приводит к частично поляризованному испусканию флуоресценции. Для каждого флуорофора моменты перехода для поглощения и испускания имеют фиксированную ориентацию, и угол между ними определяет максимальную измеряемую анизотропию r 0 , см. уравнение (5.20)]. Анизотропия (r) и поляризация (Р) флуоресценции выражаются уравнениями
(1.6), (1.7)
гдегде I || и I ┴ интенсивности флуоресценции вертикально (II) и горизонтально (┴) поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом. Анизотропия и поляризация - это выражения одного и того же явления, поэтому их можно взаимозаменять, используя уравнения (5.3) и (5.4). Некоторые факторы могут уменьшать измеряемую величину анизотропии до значений ниже максимального. Самый распространенный из них - вращательная диффузия, которая происходит за время жизни возбужденного состояния и смещает испускающий диполь флуорофора. Измерение этого параметра дает информацию об относительном угловом смешении флуорофора в интервале между поглощением и испусканием. Перенос энергии возбуждения между флуорофорами также приводит к уменьшению анизотропии.
Предположим, что единственным существенным процессом, приводящим к уменьшению анизотропии, является вращательная диффузия. Тогда измеряемая анизотропия определится выражением
,
где r 0 - анизотропия, которая должна была бы измеряться в отсутствие вращательной диффузии, а φ - время корреляции для процесса диффузии, определяемое как
φ =ηV/kТ (1.9)
где η - вязкость раствора ; k - константа Больцмана; Т - абсолютная температура; V -объем вращающегося фрагмента. Рассмотрим белок с молекулярной массой 50 000. Поскольку удельный объем белков составляет 0,73 мл/г, можно легко подсчитать, что при 25° С в водном растворе (n = 0,00894 П) ожидаемое время корреляции составляет 13 нc для безводной сферы. Поскольку белки гидрагированы, фактическое время корреляции, по-видимому, должно быть больше. Однако существенным является то, что времена вращательной корреляции для большинства белков сравнимы с типичными временами затухания флуоресценции. Поэтому результаты измерения анизотропии флуоресценции зависят от всех факторов, влияющих на скорость вращательной диффузии. По этой причине измерения поляризации флуоресценции широко используют для изучения гидродинамических свойств макромолекул.
1.5. Временная шкала молекулярных процессов в растворе
Флуоресцентная спектроскопия - эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужденных состояний. Вследствие принципа Франка - Кондона абсорбционная спектроскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те мо-иекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику.
В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов , протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс - слишком короткий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидком растворе. Вращательная диффузия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.
Тушение флуоресценции молекулярным кислородом по механизму столкновений является показательным примером размеров пространственного и временного диапазонов, представляемых временем затихания флуоресценции. Если флуорофор, находящийся в возбужденном состоянии, сталкивается с молекулой кислорода, он возвращается в основное состояние без испускания фотона. Коэффициент диффузии кислорода в воде при 25°С равен 2,5 10 -3 см 2 /с. Среднее расстояние [(Δх 2) 1/2 ], на которое может диффундировать молекула кислорода за 10 -3 с, определяется уравнением Эйнштейна:
Δ x 2 = 2Dτ (1.10)
Расстояние [ (Δх 2) 1/2 ] составляет ~ 70 Å, что сравнимо с толщиной биологической мембраны или диаметром белка. Для некоторых флуорофоров времена жизни достигают 400 нc, поэтому можно наблюдать диффузию молекул кислорода на расстояния свыше 450 А. Напротив, измерения поглощения дают сведения лишь о непосредственном окружении флуорофора и, следовательно, о мгновенном усредненном окружении.
Влияние молекулярной динамики на спектры флуоресценции также обнаруживается при рассмотрении энергий. Органические молекулы, как правило, поглощают свет в диапазоне длин волн 200 - 500 нм, что соответствует энергиям от 140 до 60 ккал/ моль. Вслед за поглощением у флуорофора изменяется (обычно возрастает) дипольный момент. Если молекулы растворителя также имеют дипольные моменты, они переориентируются вокруг диполя возбужденного состояния , понижая тем самым его энергию. Этот процесс называется релаксацией растворителя и происходит в жидких растворах за 10 -12 с. Релаксация растворителя может приводить к значительным стоксовым сдвигам. В белках триптофановые остатки поглощают свет с длиной волны 280 нм, а испускают флуоресценцию при -350 нм. Таким образом, за несколько наносекунд, проходящих до процесса испускания, расходуется 20 ккал/моль.
В основе любого эксперимента лежат измерение некоторой величины и корреляция полученных результатов с явлением, представляющим интерес для исследователя. Временной диапазон между поглощением света и последующим его испусканием достаточен для протекания нескольких процессов, каждый из которых приводит к ослаблению наблюдаемых спектральных характеристик флуоресценции. К таким процессам относятся столкновения с тушителями, вращательная и поступательная диффузия, образование комплексов с растворителями или с растворенными веществами и переориентация окружения молекулы в возбужденном состоянии с измененным дипольным моментом. Эти динамические процессы могут влиять на анизотропию флуоресценции, квантовые выходы, времена жизни и спектры испускания. В результате спектральные характеристики флуорофоров могут дать большую информацию о динамических процессах, протекающих за время испускания флуоресценции.
1.6. Флуорофоры
1.6.1 Природные флуорофоры
Из большого числа молекул биологических веществ многие являются природными, или естественными, флуорофорами. Мы кратко суммируем информацию о широко известных флуорофорах , что дает основу для последующих глав. Такое конспективное изложение не является исчерпывающим.
БЕЛКИ Триптафан - наиболее интенсивно флуоресцирующая аминокислота в белках. Около 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено триптофановыми остатками. "Этот природный флуорофор крайне чувствителен к полярности окружающей среды. Спектральные сдвиги часто являются следствием нескольких явлений, среди которых можно выделить связывание лигандов, ассоциацию белок - белок и денатурацию. Кроме того, максимумы испускания белков отражают среднюю доступность их триптофановых остатков в водной фазе. Белки поглощают свет вблизи 280 нм, а максимумы спектров флуоресценции лежат в области 320 -350 нм. Времена затухания флуоресценции триптофановых остатков лежат в диапазоне 1-6 нс.
Тирозин интенсивно флуоресцирует в растворе, однако в белках его флуоресценция значительно слабее. Денатурация белков обычно усиливает испускание тирозина. Как и для фенола, рК а тирозина очень сильно уменьшается при возбуждении, и может происходить ионизация в возбужденном состоянии.
нуклеиновые кислоты Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты обычно не флуоресцируют. Тем не менее существуют некоторые исключения. tRNA Phe из дрожжей содержит интенсивно флуоресцирующее основание, известное как Y-основание, которое имеет максимум испускания вблизи 470 нм, а время жизни ~6 нc.
Кофакторы NADH флуоресцирует сильно, и максимумы его поглощения и испускания находятся при 340 и 450 нм соответственно. NAD + не флуоресцирует. Время затухания флуоресценции NADH в водном буфере составляет примерно 0,4 нс. Флуоресцирующей группой является восстановленное никотинамидное кольцо, причем его флуоресценция частично потушена за счет столкновений с остатком аденина. При связывании NADH с белками квантовый выход его флуоресценции увеличивается обычно в четыре раза. Такое увеличение выхода обычно интерпретируют как следствие связывания NADH в вытянутой конформации, что подтверждается изучением дифракции рентгеновских лучей на гидрогеназах.
РИБОФЛАВИН И FAD. Рибофлавин, FMN (флавинмононуклеотид) и FAD (флавинадениндинуклеотид) поглотают свет в видимой области (-450 нм) и испускают в области 515 нм. Типичные времена жизни для FMN и FAD составляют 4,7 и 2,3 нс соответственно. Как и для NADH, флуоресценция флавина динамически тушится аденином. Далее, FAD также образует комплек-сымссоциаты , в которых флуоресценция флавнна потушена аденином (статическое тушение). Флагопротеины в основном не флуоресцируют, однако опять же существуют исключения.
1.6.2. Искусственные фпуорофоры
Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не позволяют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, флуоресценция белка и даже поляризация этой флуоресценции не отражают явление, которое хотят охарактеризовать количественно, В таком случае выбирают флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства,
ИЗОЦИАНАТЫ И ИЗОТИОЦИАНАТЫ ФЛУОРЕСЦЕИНА И РОДАМИНА. Эти красители широко используют в качестве меток для белков. Меченные флуоресцеином иммуноглобулины - коммерческие реактивы; их часто используют в флуоресцентной микроскопии. Именно эти вещества выбирают из-за высоких квантовых выходов и устойчивости к фото обесцвечиванию. Кроме того, благодаря большим длинам волн поглощения и испускания (рис. 1,9) сведена к минимуму проблема фоновой флуоресценции биологических образцов и можно избежать применения кварцевой оптики. Изоцианатная или изотиоцианатная группы находятся либо в мета-, либо в параположении по отношению к карбокси-группе (см. рис, l.l). Коммерческие меченые реагенты представляют собой смесь изомеров. Эти красители реагируют в первую очередь с лизиновым или цистеиновым участком белков. Времена затухания флуоресценции красителей около 4 нс, а их спектры испускания мало чувствительны к полярности растворителя. Эти красители очень подходят для количественного определения степени ассоциации небольших меченых молекул с белками на основании изменения поляризации флуоресценции.
ДАНСИЛХЛОРИД. Дансилхлорид (DNS-C1) широко используют в качестве метки для белков (рис. 1.10), особенно в тех случаях, когда проводят измерения поляризации. Это вещество давно известно [ 8] и имеет удобное вре-ся жизни флуоресценции (~ 10 нс). На спектр испускания дансильной группы сильно влияет полярность растворителя.
РИС. 1.9. Спектры возбуждения и испускания бычьего γ-глобулина. меченного зотиоцианатом флуоресцеина (по данным [ 7]).
РИС. 1.10. Часто используемые искусственные флуорофоры.
Нафтиламинсульфоновые кислоты, 1-Анилино-8-нафталинсульфоно-вяя кислота (l,8-AТS или ANS), 2-n-толуидинилнафталин-б-сульфоновая кислота (2,6-TNS или TNS) и их производные часто используют в качестве нековалентно связанных зондов для белков и мембран. Эти зонды почти не флуоресцируют в воде, но интенсивно флуоресцируют либо при растворении в неполярных растворителях, либо когда они связаны с макромолекулами. Низкий квантовый выход в водной фазе позволяет во многих случаях не учитывать эту часть флуорофора , что упрощает эксперименты. Подобные флуорофоры связываются с сывороточными альбуминами, липопротеинами, апомиоглобином, иммуноглобулинами и липидными бислоями. Места связывания имеют, по-видимому, кик полярную, так и неполярную природу.
Гидрофобные мембранные зонды. Липиды обычно не флуоресцируют. Мембраны часто метят такими зондами, как перилен, 9-винилантраЦен и 1,6-дифенилгексатриен (DРН) (рис. 1.10). Эти зонды нерастворимы в воде и встраиваются в гидрофобные участки мембран. Незамещенные многоядерные ароматические углеводороды и DPH малочувствительны к полярности растворителя. Их используют в первую очередь для оценки внутренней вязкости двойных слоев по измерениям поляризации их флуоресценции (разд. 5.7.1). Путем целенаправленного изменения химического строения зонды могут быть локализованы на избранных участках мембраны. Одним из таких примеров является триметиламмониевая соль DPH (ТМA-DPH). Полагают, что заряженный атом азота приводит к локализации ТМА-DPH в области липидно-водной границы мембран [ 14].
Другие зонды, как, например PATMAN (рис. 1.11), очень чувствительны к фазовому состоянию липидных бислоев [ 9]. При температуре перестройки мембран спектр испускания PАTМAN сжигается на 40 нм в длинноволновую область: от 425 до 465 нм. По-видимому, этот зонд реагирует на релаксацию мембраны вокруг диполи возбужденного состояния флуорофора (разд. 8.6). Были предложены и другие зонды. Чувствительность к потенциалу мембраны может быть связана с изменением ориентации зонда или его локальной концентрации в мембране , а также с влиянием электрического поля т электронное распределение в зонде [ 11]. И наконец, можно выделить зонды, которые подвергаются реакциям в возбужденном состоянии. В возбужденном состоянии зонд Р 2 -С 3 , может образовывать внутримолекулярный эксимер, и доля образовавшихся эксимеров определяет вязкость в их ближайшем окружении.
Нуклеиновые кислоты. При введении этиленового мостика флуоресценция АТР и его производных становится более интенсивной [ 12]. Такие производные ε-АТР (рис. 1.11) чувствительны к вязкости растворителя , имеют высокую предельную поляризацию флуоресценции, и времена затухания их флуоресценции близки к 23 нс. Нуклеотидные аналоги активны во многих реакциях, катализируемых ферментами. Кроме того, были синтезированы такие аналоги нуклеотидов с вытянутой конформацией, как лин-бен-зо-АМР, Эти аналоги флуоресцируют [ 13] и сохраняют способность к образованию водородных связей не модифицированных нуклеотидов.
Подводя итоги, можно сказать, что флуоресценцией обладают разнообразные молекулы и на спектральные свойства флуорофоров влияет целый ряд факторов и процессов. Как следствие этого, флуоресцентные методы полезны для изучения свойств растворов и биологических макромолекул.
РИС. 1.11. Часто используемые искусственные флуорофоры.