Elektronická paramagnetická rezonancia pre figuríny. Elektrónová paramagnetická rezonancia (EPR)
ÚVOD……………………………………………………………………………………….2
1. PRINCÍP METÓDY EPR………………………………………………………………..3
1.1. História objavu metódy EPR………………………………………………..3
1.2. Mechanické a magnetické momenty elektrónu………………………………4
1.3. Zeemanov efekt ……………………………………………………………………….. .................6
1.4. Základná rezonančná rovnica ……………………………………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………
2. CHARAKTERISTIKA SPEKTR EPR ………………………………………….10
2.1. Amplitúda signálu, tvar čiary a šírka čiary……………………………….10
2.2. Hyperjemná štruktúra EPR spektier……………………………………………….16
……………………………………………………………..18
3. ZARIADENIE RÁDIOSPEKTROMETRA EPR…………………………...22
4. APLIKÁCIA EPR V LEKÁRSKOM A BIOLOGICKOM VÝSKUME……………………………………………………………………….24
4.1 Signály EPR pozorované v biologických systémoch………………..24
4.2. Spôsob otáčania štítkov a sond………………………………………………26
4.3. Metóda spinovej pasce………………………………………………...35
ZÁVER………………………………………………………………………...39
ZOZNAM POUŽITÝCH ZDROJOV………………………..40
ÚVOD
Elektrónová paramagnetická rezonancia(EPR, electronic spin rezonance), fenomén rezonančnej absorpcie elektromagnetického žiarenia paramagnetickými časticami umiestnenými v konštantnom magnetickom poli, v dôsledku kvantových prechodov medzi magnetickými podúrovňami paramagnetických atómov a iónov (Zeemanov efekt). OTVORENÉZavojský Jevgenij Konstantinovič v Kazaň štátna univerzita v roku 1944
Pri absencii konštantného magnetického poľa H sú magnetické momenty nepárového elektróny sú nasmerované ľubovoľne, stav sústavy takýchto častíc je energeticky degenerovaný. Keď sa aplikuje pole H, projekcie magnetických momentov na smer poľa nadobudnú určité hodnoty a degenerácia sa odstráni (Zeemanov efekt), t.j. rozdelí sa hladina energie. elektróny E 0 .
Keďže na nižšej úrovni číslo elektróny viac v súlade s Boltzmannovým rozdelením, potom bude dochádzať prevažne k rezonančnej absorpcii energie striedavého magnetického poľa (jeho magnetickej zložky).
Na nepretržité pozorovanie absorpcie energie nestačí rezonančná podmienka, pretože vplyvom elektromagnetického žiarenia sa populácie podúrovní vyrovnajú (efekt saturácie). Relaxačné procesy sú nevyhnutné na udržanie Boltzmannovho rozloženia podúrovňových populácií.
Hlavnými parametrami EPR spektier sú intenzita, tvar a šírka rezonancie linky , g-faktor, konštanty jemných a hyperjemných (HFS) štruktúr.
1. PRINCÍP METÓDY EPR
1.1.História objavu metódy EPR
Metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie (EPR, EPRelektrónová paramagnetická rezonancia, ESR elektrónová spinová rezonancia ) je hlavnou metódou štúdiaparamagnetické častice. K paramagnetickým časticiam s dôležitým biologickýmčo znamená, že existujú dva hlavné typy, ktorými sú voľné radikály a komplexy kovovpremenlivá valencia (ako Fe, Cu, Co, Ni, Mn).
Metódu elektrónovej paramagnetickej rezonancie objavil v roku 1944 E.K. Zavoisky pri štúdiu interakcie mikrovlnného elektromagnetického žiarenia so soľami kovov. Všimol si, že monokryštál CuCl2 umiestnený v konštantnom magnetickom poli 40 Gauss (4 mT) môže absorbovať žiarenie s frekvenciou asi 133 MHz.
Priekopníkmi využitia EPR v biologickom výskume v ZSSR boli L.A. Blumenfeld a A.E. Kalmanson, ktorý začal študovať voľné radikály bielkovín získaných pôsobením ionizujúceho žiarenia.
Postupom času syntéza stabilných nitroxidových radikálov výrazne rozšírila rozsah metódy EPR v biologickom a medicínskom výskume. Dnes je táto metóda jednou z najpoužívanejších metód modernej vedy.
1.2. Mechanické a magnetické momenty elektrónu
Metóda EPR je založená na absorpcii elektromagnetického žiarenia v rádiovom dosahu nespárovanými elektrónmi v magnetickom poli.
Je dobre známe, že elektrón v atóme sa podieľa na orbitálnom a spinálnom pohybe, ktorý možno charakterizovať pomocou zodpovedajúcich mechanických a magnetických momentov. Orbitálny magnetický moment teda súvisí s mechanickým prejavom
(1)
kde je magnetický orbitálny moment a je mechanický orbitálny moment. Na druhej strane, mechanickú orbitálnu hybnosť možno vyjadriť ako orbitálne kvantové číslo
(2)
Dosadením výrazu (1.2) do (1.1) dostaneme to
Množstvo je elementárny magnetický moment a pre elektrón sa nazýva Bohrov magnetón. Označuje sa písmenom β a rovná sa 9,27 1024 J/T.
Pre spinový magnetický moment možno napísať podobné výrazy
(4)
(5)
(6)
kde je spinový magnetický moment, PS mechanický magnetický moment a s spinové kvantové číslo. Je dôležité poznamenať, že koeficient proporcionality medzi a Ps (e/m ) dvakrát toľko ako pre a Pl(e/2m).
V dôsledku toho bude celkový magnetický moment elektrónu, ktorý je vektorom sa rovná súčtu vektory orbitálnych a spinových magnetických momentov
(7)
Pretože absolútne hodnoty a môžu sa značne líšiť, pre pohodlie pri zohľadnení príspevku orbitálnych a spinových magnetických momentov k celkovému magnetickému momentu elektrónu sa zavedie koeficient úmernosti, ktorý ukazuje podiel každého z nich.momenty v celkovom magnetickom momente hodnota g alebo g-faktor.
kde Pj plný mechanický moment elektrónu, rovný Pl + Ps . g -Koeficient sa rovná jednej at s = 0 (t. j. pri absencii rotácie) a rovná sa dvom, ak je orbitálna hybnosť nula ( l = 0). g - Faktor je identický s Landeovým spektroskopickým deliacim faktorom a možno ho vyjadriť ako celkové kvantové čísla S, P a J:
kde (9)
Pretože vo väčšine prípadov sú elektrónové orbitály veľmi odlišné od sférických orbitálov, orbitálny magnetický moment má relatívne malý príspevok k celkovému magnetickému momentu. Pre zjednodušenie výpočtov možno tento príspevok zanedbať. Okrem toho, ak nahradíme spinový mechanický moment jeho priemetom do zvoleného smeru (napríklad do smeru magnetického poľa), dostaneme nasledujúci výraz:
(10)
kde eh/4πm je Bohrov magnetón a je magnetické kvantové číslo, ktoré je projekciou spinového magnetického momentu do zvoleného smeru a rovná sa ±1/2.
1 .3. Zeemanov efekt
Obrázok 1 Orientácia elektrónov vo vonkajšom magnetickom poli ( H).
Pri absencii vonkajšieho magnetického poľa sú magnetické momenty elektrónov náhodne orientované (obr. 1 vľavo) a ich energia sa od seba prakticky nelíši (E0). Pri pôsobení vonkajšieho magnetického poľa sa magnetické momenty elektrónov v poli orientujú v závislosti od veľkosti spinového magnetického momentu (obr. 1 vpravo) a ich energetická hladina sa rozdelí na dva (obr. 2). ).
Obrázok 2 Štiepenie energetické hladiny jednotlivé elektróny v magnetickom poli (Zeemanov jav).
Energiu interakcie magnetického momentu elektrónu s magnetickým poľom vyjadruje rovnica
(11)
kde μ je celkový magnetický moment elektrónu, H sila magnetického poľa a cos(μH) kosínus uhla medzi vektormi μ a H.
V našom prípade bude interakčná energia elektrónu s vonkajším magnetickým poľom
(12)
a energetický rozdiel medzi týmito dvoma úrovňami je
(13)
Energetické hladiny elektrónov umiestnených v magnetickom poli sa teda delia v tomto poli v závislosti od veľkosti spinového magnetického momentu a intenzity magnetického poľa ( Zeemanov efekt).
1.4 Základná rezonančná rovnica
Počet elektrónov v skúmanom systéme, ktoré majú konkrétnu energiu, sa určí v súlade s Boltzmannovým rozdelením, a to
(14)
kde a je počet elektrónov na vyššej alebo nižšej energetickej úrovni zodpovedajúci magnetickému momentu elektrónu so spinom +1/2 alebo 1/2.
Ak elektromagnetická vlna dopadne na systém elektrónov v magnetickom poli, potom pri určitých hodnotách energie dopadajúcich kvánt dôjde k prechodom elektrónov medzi úrovňami.
Nevyhnutnou podmienkou je rovnosť energie dopadajúceho kvanta (hν) a energetický rozdiel medzi hladinami elektrónov s rôznymi spinmi (gβH).
AE = hν = gβH (15)
Táto rovnica vyjadruje základnú podmienku absorpcie energie elektrónmi a je tzvhlavná rezonančná rovnica. Pod vplyvom žiarenia budú elektróny, ktoré sú na vyššej energetickej úrovni, emitovať energiu a vrátia sa na nižšiu úroveň, tento jav sa nazýva indukovaná emisia. Elektróny na nižšej úrovni absorbujú energiu a presunú sa na vyššiu úroveň.
energetickej úrovni, tento jav sa nazývarezonančná absorpcia. Keďže pravdepodobnosti jednotlivých prechodov medzi energetickými hladinami sú rovnaké a celková pravdepodobnosť prechodov je úmerná počtu elektrónov nachádzajúcich sa na danej energetickej hladine, prevládne absorpcia energie nad jej emisiou. Je to spôsobené tým, že ako vyplýva z Boltzmannovho rozdelenia, populácia nižšej úrovne je vyššia ako populácia hornej energetickej úrovne.
Malo by sa pamätať na to, že rozdiel v energetických hladinách elektrónu v magnetickom poli (ako aj iných nabitých častíc so spinom, napríklad protóny) je spojený s prítomnosťou vlastného magnetického momentu v elektróne. Spárované elektróny majú kompenzované magnetické momenty a nereagujú na vonkajšie magnetické pole, takže bežné molekuly nedávajú EPR signály. EPR teda umožňuje zisťovať a študovať vlastnostivoľné radikály(majú nespárovaný elektrón vo vonkajších orbitáloch) a kovové komplexy premenlivej valencie (v ktorých nespárovaný elektrón patrí do hlbších elektrónových obalov). Tieto dve skupiny paramagnetických častíc sa často označujú ako paramagnetické centrá.
2. CHARAKTERISTIKA SPEKTRA EPR
Metóda EPR nám umožňuje študovať vlastnosti paramagnetických centier prostredníctvom absorpčných spektier elektromagnetického žiarenia týmito časticami. Keď poznáme charakteristiky spektier, môžeme posúdiť aj vlastnosti paramagnetických častíc. Hlavnými charakteristikami spektier sú amplitúda, šírka čiary, tvar čiary, g -faktorová a hyperjemná štruktúra spektier.
2.1. Amplitúda signálu, tvar čiary a šírka čiary
Amplitúda signálu
Signál EPR je prvou deriváciou absorpčného spektra (obr. 3). Plocha pod absorpčnou čiarou je úmerná koncentrácii paramagnetických častíc vo vzorke. Koncentrácia paramagnetických centier je teda úmerná prvému integrálu pod absorpčnou čiarou alebo druhému integrálu EPR spektra. Ak majú dva signály rovnakú šírku, potom koncentrácie paramagnetických centier korelujú ako amplitúdy signálu v absorpčnom spektre.
Obrázok 3 - EPR signál. Vľavo závislosť mikrovlnnej absorpcie od intenzity magnetického poľa (H); vpravo prvá derivácia tejto závislosti. EPR spektrometre zaznamenávajú krivky druhého typu.
Na stanovenie koncentrácie sa merajú plochy pod absorpčnou krivkou pre referenčnú vzorku so známou koncentráciou paramagnetických centier a pre meranú vzorku a neznáma koncentrácia sa zistí z pomeru za predpokladu, že obe vzorky majú rovnaký objem:
(16)
kde a sú koncentrácie meranej vzorky a referenčnej vzorky a S x a S 0 plocha pod absorpčnými čiarami meraného signálu a referenčnej vzorky.
Na určenie oblasti pod absorpčnou čiarou neznámeho signálu môžete použiť metódu numerickej integrácie
(17)
kde f" (H ) prvá derivácia absorpčnej čiary (EPR spektrum), F(H ) funkcia absorpčnej čiary a H sila magnetického poľa.
(18)
Vzhľadom na to, že F (H ) . H v bodoch -∞ a ∞ je nula a dF (H ) sa rovná f "(H) dH, dostaneme
(19)
kde f" (H ) prvá derivácia absorpčnej čiary alebo EPR spektra. Vzhľadom na to je ľahké prejsť od integrálu k integrálnemu súčtu H = nΔH, dostaneme
(20)
kde ΔH krok zmeny magnetického poľa, a n i číslo kroku. Plocha pod absorpčnou krivkou sa teda bude rovnať súčinu druhej mocniny kroku magnetického poľa a súčtu súčinov amplitúdy EPR spektra a čísla kroku. Z výrazu (20) je ľahké vidieť, že pre veľké n (t.j. ďaleko od stredu signálu) môže byť príspevok vzdialených častí spektra dosť veľký aj pri malých hodnotách amplitúdy signálu.
Tvar čiary
Hoci podľa základnej rovnice rezonancie dochádza k absorpcii až vtedy, keď sa energia dopadajúceho kvanta rovná energetickému rozdielu medzi hladinami nepárových elektrónov, EPR spektrum je v určitom okolí rezonančného bodu spojité. Funkcia popisujúca signál EPR sa nazýva funkcia tvaru čiary. V zriedených roztokoch, keď je možné zanedbať interakciu medzi paramagnetickými časticami, je absorpčná krivka opísaná Lorentzovou funkciou:
(21)
kde je funkcia krivky absorpcie v bode rezonancie, je hodnota poľa v bode rezonancie, je šírka signálu v polovici maxima. Podobný zápis sa používa pre krivku absorpcie opísanú Gaussovou funkciou.
(22)
Gaussova funkcia je obalom EPR spektra, ak existuje interakcia medzi paramagnetickými časticami. Pri určovaní plochy pod absorpčnou krivkou je obzvlášť dôležité zvážiť tvar čiary. Ako je zrejmé z vyššie uvedených vzorcov, Lorentzova línia má pomalší rozpad a teda širšie krídla, čo môže spôsobiť značnú chybu pri integrácii spektra.
Šírka čiary
Šírka spektra EPR závisí od interakcie magnetického momentu elektrónu s magnetickými momentmi okolitých jadier (mriežka) (spin-mriežková interakcia) a elektrónov (spin-spin interakcia). V neprítomnosti týchto interakcií by energia absorbovaná elektrónmi viedla k zníženiu rozdielu v úrovni populácie a ukončeniu absorpcie.
V experimente však nie je pozorovaná žiadna zmena v rozdiele populácie hladiny vzhľadom na to, že existujú procesy, pri ktorých sa absorbovaná energia prenáša do prostredia a elektróny sa vracajú na počiatočnú úroveň. Takéto procesy sa nazývajú relaxačné procesy, udržiavajú konštantný rozdiel v populácii energetických hladín. Relaxačný mechanizmus spočíva v prenose elektromagnetickej energie kvanta do mriežky alebo okolitých elektrónov a návrate elektrónu do
nízka energetická hladina. Čas, počas ktorého elektrón zostáva na vysokej energetickej úrovni, sa nazýva relaxačný čas. V súlade s tým existuje čas spinovej mriežky ( T 1) a spin-spin ( T 2) relaxácia.
Jedným z dôvodov rozšírenia absorpčných pásiem v EPR signáloch sú vlnové vlastnosti elementárnych častíc, ktoré sa prejavujú existenciou známeho Heisenbergovho princípu vzťahu neurčitosti. Podľa tohto princípu platí, že čím presnejšie je nastavený čas pozorovania (čím menšie Δ t ), tým väčšia je neistota energie častíc (:
(23)
Ak pripustíme, že Δ t je čas relaxu T a AE zodpovedá g βΔH , potom to dostaneme
(24)
tie. neistota šírky čiary je nepriamo úmerná dobe relaxácie. Pozorovaný relaxačný čas sa považuje za súčet relaxačných časov spin-mriežky a spin-spin.
(25)
Voľné radikály v roztokoch majú T1>> T 2, preto bude šírka čiary závisieť hlavne od T2.
„Prirodzené“ rozšírenie signálu EPR, ktoré závisí od času spin-mriežky a spin-spin relaxácie, nie je jediným mechanizmom, ktorý ovplyvňuje šírku čiary. c Ignala. Tiež zohrávajú dôležitú úlohuinterakcia dipól-dipól; anizotropia g -faktor a; dynamické rozšírenie línie a výmena spinov.
V jadre interakcia dipól-dipólspočíva v interakcii magnetického momentu nepárového elektrónu s lokálnym magnetickým poľom vytvoreným susednými elektrónmi a jadrami. Sila magnetického poľa v mieste, kde sa nachádza nespárovaný elektrón, závisí od vzájomnej orientácie magnetických momentov nespárovaného elektrónu a iného elektrónu alebo jadra a od vzdialenosti medzi týmito centrami. Zmena energie nepárového elektrónu je určená rovnicou
(26)
kde μ je magnetický moment elektrónu, θ je uhol medzi interagujúcimi magnetickými momentmi R vzdialenosť medzi nimi.
Príspevok anizotropia g-faktoraRozšírenie línie EPR je spôsobené tým, že orbitálny pohyb elektrónu vytvára magnetické pole, s ktorým interaguje spinový magnetický moment. Tým vzniká posun veľkosti vonkajšej intenzity poľa, pri ktorom je pozorovaná rezonancia, t.j. k posunu v polohe maxima signálu EPR. To sa zase prejavuje zjavnou odchýlkou g -faktor voľného elektrónu od hodnoty 2,00. Na druhej strane vplyv orbitálneho magnetického poľa na elektrón
závisí od orientácie molekuly vzhľadom na vonkajšie magnetické pole, čo vedie k rozšíreniu EPR signálu pri meraní v systéme pozostávajúcom z mnohých náhodne orientovaných molekúl.
Rozšírenie EPR signálu môže byť spojené aj so vzájomnou transformáciou dvoch paramagnetických častíc. Ak má teda každá z častíc svoje vlastné spektrum EPR, potom zvýšenie rýchlosti vzájomnej transformácie povedie k rozšíreniu čiary, pretože v tomto prípade sa životnosť radikálu v každom stave znižuje. Taká zmenašírka signálu je tzvdynamické rozšírenie signál.
Výmena točenia je ďalším dôvodom na rozšírenie signálu EPR. Mechanizmus rozšírenia signálu pri spinovej výmene spočíva v zmene smeru spinového magnetického momentu elektrónu na opačný pri jeho zrážke s iným nepárovým elektrónom alebo iným paramagnetom. Keďže takáto kolízia znižuje životnosť elektrónu v danom stave, opäť sa EPR signál rozšíri. Najčastejším prípadom rozšírenia spin-výmennej línie EPR je rozšírenie signálu v prítomnosti kyslíka alebo paramagnetických kovových iónov.
2.2 Hyperjemná štruktúra EPR spektier
Rozdelenie jednej línie EPR na niekoľko línií je založené na tomto javehyperjemná interakciat.j. interakcia magnetických momentov nepárových elektrónov () s magnetickými momentmi susedných jadier (
Obrázok 4 poskytuje vysvetlenie hyperjemnej interakcie. Nespárovaný elektrón v radikále môže byť umiestnený blízko protónu, napríklad ako v etanolovom radikále (1). Pri absencii vplyvu blízkych protónov má elektrón signál vo forme jedinej čiary (2). Protón má však aj magnetický moment, ktorý je orientovaný vo vonkajšom magnetickom poli ( H 0) v dvoch smeroch (pozdĺž poľa alebo proti poľu), pretože ako elektrón má číslo točenia S = ½. Ako malý magnet vytvára protón magnetické pole, ktoré má v mieste elektrónu určité hodnoty +Hp alebo Hp v závislosti od orientácie protónu (3). Výsledkom je, že celkové magnetické pole aplikované na nespárovaný elektrón (4) má hodnotu o niečo väčšiu (+ Hp) alebo o niečo nižšiu (Hp) ako v neprítomnosti protónu (). Signál EPR radikálu preto pozostáva z dvoch pásiem, ktorých vzdialenosť od pôvodného stredu pásu sa rovná Hp (5).
Obrázok 4 - Hyperjemné rozdelenie signálu EPR v etanolovom radikále.
1 etanolový radikál. 2 EPR signál elektrónu vo vonkajšom poli. 3 orientácia protónov vo vonkajšom magnetickom poli. 4 zvýšenie alebo zníženie poľa pôsobiaceho na elektrón v dôsledku uloženia magnetického poľa protónu ( H p) na vonkajšie magnetické pole. 5 EPR signál radikálu, v ktorom je magnetické pole protónu superponované na vonkajšie magnetické pole.
V našom príklade bol spin jadra interagujúceho s nespárovaným elektrónom ± 1/2, čo nám nakoniec poskytlo rozdelenie na dve línie. Táto hodnota spinu je charakteristická pre protóny. Jadrá atómov dusíka (N14) majú spin celé číslo . Môže nadobudnúť hodnoty ±1 a 0. V tomto prípade, keď nepárový elektrón interaguje s jadrom atómu dusíka, bude pozorované rozdelenie na tri rovnaké čiary, ktoré zodpovedajú hodnote spinu +1, 1 a 0. Vo všeobecnom prípade počet
čiary v spektre EPR sú 2 m N+1. (pozri nižšie, obr. 10)
Prirodzene, počet nepárových elektrónov a teda plocha pod krivkou absorpcie EPR nezávisia od veľkosti jadrového spinu a sú konštantnými hodnotami. V dôsledku toho, keď je jeden signál EPR rozdelený na dva alebo tri, intenzita každej zložky bude 2 alebo 3 krát nižšia.
Veľmi podobný obraz vzniká, ak nespárovaný elektrón interaguje nie s jedným, ale s niekoľkými ekvivalentnými (s rovnakou hyperjemnou interakčnou konštantou) jadrami, ktoré majú magnetický moment iný ako nula, napríklad dva protóny. V tomto prípade vznikajú tri stavy zodpovedajúce orientácii spinov protónov: (a) oba pozdĺž poľa, (b) oba proti poľu a (c) jeden pozdĺž poľa a jeden proti poľu. Možnosť (c) je dvakrát pravdepodobnejšia ako (a) alebo (b), pretože možno vykonať dvoma spôsobmi. V dôsledku takéhoto rozloženia nepárových elektrónov sa jedna čiara rozdelí na tri čiary s pomerom intenzity 1:2:1. Vo všeobecnosti pre n ekvivalentných jadier so spinom mN, počet riadkov je n 2 m N +1.
2.3. Vlastnosti atómov s magnetickými jadrami, konštanty, HFI nespárovaného elektrónu s jadrom
|
Atom |
Hromadné číslo |
jadrový spin |
x 10-4 T |
|
|
99,98 |
||||
|
7,52 |
54,29 |
|||
|
92,48 |
143,37 |
|||
|
316,11 |
||||
|
93,26 |
82,38 |
|||
|
72,15 |
361,07 |
|||
|
27,85 |
1219,25 |
|||
|
819,84 |
AT - elektronické systémy (väčšina organických voľných radikálov)hustota odstreďovaniav bode jadra sa rovná nule (uzlový bod p-orbitálu) a realizujú sa dva mechanizmy vzniku SHF (spin transfer): konfiguračná interakcia a superkonjugačný efekt. Mechanizmus interakcie konfigurácie je ilustrovaný zvážením CH-fragmentu (obr. 5). Keď sa v p-orbitále objaví nepárový elektrón , jeho magnetické pole interaguje s pár elektrónov -väzby CH tak, že sa čiastočne deparujú (spinová polarizácia), čo má za následok protón sa javí negatívnehustota odstreďovania, pretože interakčné energie sa točí a rôzne. Stav znázornený na obr. 5, a, je stabilnejší, pretože pre uhlík atóm , nespárované elektrón , v súlade s Hundovo pravidlo maximálnemnohosť. Pre systémy tohto typu existuje vzťah medzi konštantou STV a protón a hustota odstreďovaniana zodpovedajúcom uhlíku atóm , určené vzťahom McConnell: kde Q = -28 x 10 -4 T, - hustota odstreďovania na atóme uhlíka . Prenos spinu mechanizmom konfiguračnej interakcie sa realizuje pre aromatické protóny a -protóny v organických voľných radikáloch.
Obrázok 5 - Možné konfigurácie odstreďovania pre- spojenie orbitálov atóm vodíka vo fragmente CH a p-orbitály atóm uhlíka so spinom a - sa točí na väzbe -orbitály a p-orbitály atóm uhlíka paralelné, b - to isté späť sú antiparalelné.
Účinok prekonjugácie sa priamo prekrýva orbitály nepárového elektrónu a magnetické jadrá. Najmä v alkylových radikáloch sa HFI objavuje týmto mechanizmom na jadrách-protóny. Napríklad v etylovom radikále na-protóny HFC je určený interakciou konfigurácie a ďalej-protóny - superkonjugácia. Ekvivalencia CTB s tromi protóny metylová skupina je v tomto prípade spôsobená rýchlou rotáciou skupiny CH 3 vzhľadom na väzbu C C. Pri absencii voľnej rotácie (alebo v prípade sťaženej rotácie), ktorá sa pri mnohých systémoch s rozvetvenými alkylovými substituentami alebo v monokryštálových vzorkách realizuje v kvapalnej fáze, konštanta HFI s-protóny je určený výrazom, kde - dihedrálny uhol medzi 2p z -orbital -atóm uhlíka a CH väzba, V04 x 10-4 T určuje príspevok rotácie polarizácia jadrovým jadrom (konfiguračná interakcia), B 245 x 10-4 Tl. V limite rýchlej rotácie a n \u003d 2,65 x 10-3 T. V spektroskopii EPR tripletových stavov (S=1), okrem elektrón-nukleárnych interakcií (HFI), je potrebné brať do úvahy aj interakciu nepárových elektróny spolu. Je určená interakciou dipól-dipól spriemerovanou na nulu v kvapalnej fáze a opísanou parametrami nulového delenia D a E, ktoré závisia od vzdialenosti medzi neuloženými elektróny (radikálne páry), ako ajvýmenná interakcia(izotropné) v dôsledku priameho prekrývania orbitály nepárových elektrónov (spin exchange), ktorý je opísaný výmenným integrálom J výmena Pre biradikály , v ktorom každé z radikálových centier má jedno magnetické jadro s konštantou HFI a na tomto jadre, v prípade rýchlej (silnej) výmeny J výmena a, a každý nespárovaný elektrón biradikálový systém interaguje s magnetickými jadrami oboch radikálových centier. So slabou výmenou (J výmena a) EPR spektrá každého radikálového centra sa zaznamenávajú nezávisle, to znamená, že sa zaznamenáva "monoradikálový" obraz. Závislosť J výmena z t-ry a rozpúšťadla umožňuje získať dynamické charakteristiky biradikálového systému (frekvenčná a energetická bariéra výmeny spinov).
- RÁDIOSPEKTROMETR EPR ZARIADENIE
Zariadenie rádiového spektrometra EPR len veľmi vzdialene pripomína zariadenie spektrofotometra na meranie optickej absorpcie vo viditeľnej a ultrafialovej časti spektra (obr. 6).
Obrázok 6 Zariadenie EPR spektrometra.
Zdrojom žiarenia v rádiovom spektrometri je klystron, čo je rádiová lampa, ktorá vydáva monochromatické žiarenie v rozsahu centimetrových vĺn.
Úlohu membrány v rádiovom spektrometri plní atenuátor, ktorý umožňuje dávkovať výkon dopadajúci na vzorku. Kyveta so vzorkou v rádiovom spektrometri je umiestnená v špeciálnej jednotke nazývanej rezonátor. Rezonátor je dutý rovnobežnosten vyrobený z kovu, ktorého dutina má valcový alebo obdĺžnikový tvar. Obsahuje absorpčnú vzorku. Rozmery rezonátora sú také, že prichádzajúce žiarenie v ňom vytvára stojaté elektromagnetické vlnenie. Prvok, ktorý v optickom spektrometri úplne chýba, je elektromagnet, ktorý vytvára konštantné magnetické pole potrebné na rozdelenie energetických hladín elektrónov. Žiarenie, ktoré prešlo meranou vzorkou, dopadá na detektor, následne sa signál detektora zosilní a zaznamená na záznamník alebo počítač. Zvláštnosť konštrukcie rádiového spektrometra spočíva v tom, že žiarenie rádiového rozsahu sa prenáša zo zdroja do vzorky a následne do detektora pomocou špeciálnych pravouhlých trubíc, ktoré slúžia ako vlnovody. Rozmery prierezu vlnovodov sú určené vlnovou dĺžkou prenášaného žiarenia. Táto vlastnosť prenosu rádiovej emisie cez vlnovody určuje skutočnosť, že na záznam EPR spektra v rádiovom spektrometri sa používa konštantná frekvencia žiarenia a rezonančný stav sa dosahuje zmenou veľkosti magnetického poľa.
Ďalšou dôležitou vlastnosťou rádiového spektrometra je, že toto zariadenie nemeria absorpciu (A) elektromagnetických (mikrovlnných) vĺn, ale prvú deriváciu absorpcie vzhľadom na intenzitu magnetického poľa dA/dH. Ide o to, že na meranie absorpcie je potrebné porovnať intenzity prenášaného žiarenia meraného a kontrolného objektu (povedzme prázdnej kyvety), pričom pri meraní prvej derivácie nie je potrebný kontrolný objekt. Pri zmene magnetického poľa sa intenzita mikrovlnných vĺn, ktoré prešli prázdnym priestorom alebo neabsorbujúcim objektom, nemení a prvá derivácia absorpcie sa rovná nule. Ak mikrovlnné vlny prechádzajú objektom s paramagnetickými centrami, dochádza k absorpcii a jej veľkosť závisí od sily magnetického poľa. Zmeníme pole a zmení sa absorpcia, čo sa prejaví zmenou intenzity meraného mikrovlnného kmitania. Práve táto zmena intenzity meranej mikrovlny s malou moduláciou magnetického poľa okolo jeho danej hodnoty umožňuje určiť dA / dH v každom bode H, čím sa získajú spektrá, alebo EPR signály.
- APLIKÁCIA EPR V LEKÁRSKOM A BIOLOGICKOM VÝSKUME
- Signály EPR pozorované v biologických systémoch
Využitie metódy EPR v biologickom výskume je spojené so štúdiom dvoch hlavných typov paramagnetických centier – voľných radikálov a kovových iónov premenlivej valencie. Štúdium voľných radikálov v biologických systémoch je spojené s ťažkosťami, ktoré spočívajú v nízkej koncentrácii voľných radikálov vznikajúcich počas životnej aktivity buniek. Podľa rôznych zdrojov je koncentrácia radikálov v normálne metabolizujúcich bunkách približne M, pričom moderné rádiové spektrometre umožňujú meranie koncentrácií radikálov M. Koncentráciu voľných radikálov je možné zvýšiť spomalením ich smrti alebo zvýšením rýchlosti ich vzniku. . V experimentálnych podmienkach vzdelávanie
Radikály sa dajú najľahšie pozorovať pri ožarovaní biologických objektov pri veľmi nízkej teplote (povedzme 77K) pri ich ožarovaní UV alebo ionizujúcim žiarením. Štúdium štruktúry radikálov viac či menej zložitých biologicky dôležitých molekúl získaných za takýchto podmienok bolo jednou z prvých oblastí aplikácie metódy EPR v biologickom výskume (obr. 7). Druhou oblasťou použitia metódy EPR v biologickom výskume bolo štúdium kovov s premenlivou mocnosťou a/alebo ich komplexov, ktoré existujú. in vivo . V dôsledku krátkych relaxačných časov je možné EPR signály metaloproteínov pozorovať len pri nízkych teplotách, napríklad pri teplote tekutého dusíka alebo dokonca hélia.
Obrázok 7 - EPR spektrá cysteínu ožiareného UV žiarením pri teplote kvapalného dusíka (77 K) a bežnej teplote (300 K).
Ako príklad na obr. 8 ukazuje EPR spektrum pečene potkana. Na ňom môžete vidieť signály cytochrómu P-450, ktoré majú g -faktor 1,94 a 2,25, signál methemoglobínu s g - faktor 4,3 a signál voľných radikálov patriacich k semichinónovým radikálom kyseliny askorbovej a flavínov s g-faktor 2,00.
Obrázok 8 - EPR spektrum pečene potkana.
Signály EPR niektorých radikálov však možno pozorovať aj pri teplote miestnosti. Tieto signály zahŕňajú EPR signály mnohých semichinónových alebo fenoxy radikálov, ako je semichinónový radikál ubichinónu, fenoxy a semichinónový radikál α-tokoferolu (vitamín E), vitamín D a mnohé ďalšie (obr. 9).
Obrázok 9 - EPR signály semichinónových a fenoxyradikálov.
- Metóda rotácie štítku a sondy
Dôležitou etapou vo vývoji aplikácie metódy EPR v biologickom výskume bola syntéza stabilných voľných radikálov. Spomedzi týchto radikálov sú najpopulárnejšie nitroxidové radikály.
Stabilita nitroxylových radikálov je spôsobená priestorovým skríningom skupiny NO. , ktorý má nepárový elektrón, štyri metylové skupiny, ktoré bránia reakcii s účasťou voľnej valencie. Takýto skríning však nie je absolútny a stále môže nastať reakcia redukcie voľnej valencie. Kyselina askorbová je napríklad dobrým redukčným činidlom pre nitroxidové radikály.
EPR spektrum nitroxidových radikálov zvyčajne pozostáva z troch čiar rovnakej intenzity v dôsledku interakcie nepárového elektrónu s jadrom atómu dusíka (obr. 10).
Obrázok 10 - Vzorec a EPR spektrum nitroxy radikálu 2,2,6,6-
tetrametyl-piperidín-1-oxyl (TEMPO).
Nechajme bokom zložitú teóriu, ktorá vysvetľuje závislosť tvaru signálu EPR od pohyblivosti sondy a obmedzme sa na veľmi schematickú prezentáciu toho, čo bolo pozorované v experimentoch. Ak je nitroxidový radikál vo vodnom roztoku, potom je jeho rotácia izotropná a pomerne rýchla a pozoruje sa EPR signál pozostávajúci z troch úzkych symetrických čiar (obr. 11, hore). So znižovaním rýchlosti otáčania sa čiary rozširujú a mení sa amplitúda zložiek spektra (obr. 11, stred). Ďalšie zvýšenie viskozity média vedie k ešte väčšej zmene signálu EPR rotačnej sondy (obr. 11, dole).
Pre kvantitatívny popis rotačného pohybu radikálu sa používa pojem rotačný korelačný čas (τс). Rovná sa času rotácie nitroxidového radikálu o uhol π/2. Na základe analýzy signálu EPR možno korelačný čas odhadnúť pomocou empirickej rovnice
(27)
kde A je šírka pásma EPR spektra pri nízkej hodnote poľa a a je intenzita zložiek s vysokým a nízkym poľom EPR spektra. Túto rovnicu možno použiť s korelačným časom 5 až s.
Syntéza stabilných nitroxidových radikálov rodiny TEMPO bola dôležitým krokom pri použití metódy EPR na štúdium vnútornej viskozity biologických membrán a proteínov pri riešení medicínskych a biologických problémov.
Obrázok 11 - EPR spektrum TEMPO v rôznych časoch rotačnej korelácie τс (čísla naľavo od spektra).
Deriváty TEMPO však, žiaľ, majú jednu podstatnú nevýhodu – pre ich amfifilitu je ťažké určiť lokalizáciu tejto sondy a odpovedať tak na otázku, kde v skutočnosti mikroviskozitu určujeme. Tento problém bol prakticky vyriešený, keď sa objavili takzvané „sondy spinu mastných kyselín“, t.j. zlúčeniny, v ktorých bola molekula nitroxy radikálu kovalentne pripojená k molekule mastnej kyseliny. V tomto prípade spektrum EPR nepochybne odráža vlastnosti hydrofóbnej (lipidovej) fázy skúmaného systému, kde je sonda vložená. Obrázok 12 ukazuje schematickú štruktúru molekuly spinovej sondy mastnej kyseliny, 5-doxyl stearátu, v ktorej je nitroxylový radikál (doxyl, zlúčenina príbuzná štruktúre TEMPO) pripojený k uhlíku 5 molekuly kyseliny stearovej. Charakteristickým znakom pohybu takejto sondy je veličina nazývaná parameter usporiadania S , ktorý charakterizuje stupeň asymetrie rotácie sondy vzhľadom na pozdĺžnu a priečnu os jej molekuly. Parameter usporiadania možno zistiť z charakteristík spektra EPR pomocou empirickej rovnice
(28)
kde A|| a A ⊥ parametre uvedené na obrázku. Teoreticky sa parameter usporiadania môže meniť od 0 do 1 so zmenou viskozity a štruktúry membrány. Pri dokonale symetrickej rotácii, keď je rýchlosť rotácie okolo troch osí rovnaká (čo je typické pre sférické častice v izotropnom prostredí), je parameter poradia rovný nule. Parameter usporiadania sa rovná 1, ak sa os otáčania sondy zhoduje s normálou na membránu a nedochádza k žiadnej rotácii vzhľadom na ostatné osi. Pri nízkych teplotách alebo v membránach zo syntetických nasýtených fosfolipidov sa sonda otáča prevažne okolo dlhej osi molekuly, orientovanej cez membránu. V tomto prípade má parameter objednávania vysoké hodnoty. So znižovaním viskozity membrány klesá hodnota objednávacieho parametra.
Obrázok 12 Chemický vzorec a EPR spektrum 5 doxylstearátu.
Veľmi cennou vlastnosťou spinových sond s obsahom mastných kyselín je schopnosť merať objednávací parameter v rôznych vzdialenostiach od povrchu membrány, takzvaný objednávkový profil alebo viskozitný profil. Na to sa používa sada spinových sond, čo sú molekuly rovnakej mastnej kyseliny, ktoré obsahujú nitroxidový fragment v rôznych vzdialenostiach od karboxylovej skupiny. Používajú sa napríklad spinové sondy s nitroxylovým radikálom s 5, 7, 12 a 16 atómami uhlíka kyseliny stearovej. Súbor týchto zlúčenín umožňuje merať parameter S vo vzdialenosti 3,5, 5, 8,5 a 10,5 angstromov od povrchu membrány (obr. 13).
Obrázok 13 - Zmena signálu EPR po odstránení nitroxylového radikálu z polárnej karboxylovej skupiny mastnej kyseliny.
Zvyčajne sa EPR spektrá spinovej sondy zahrnutej v membráne a sondy v okolitom vodnom roztoku môžu výrazne líšiť. Táto vlastnosť bola využitá na vytvorenie novej triedy spinových sond, ktoré merajú medzifázový potenciál membrány (často označovaný ako povrchový potenciál). Na meranie tohto potenciálu sa meria distribučný koeficient voda/membrána neutrálnej a nabitej sondy. Pretože nabitá sonda interaguje s nábojmi umiestnenými na povrchu membrány, jej distribučný koeficient sa bude líšiť od koeficientu neutrálnej sondy. Pomer distribučných koeficientov slúži ako miera povrchového potenciálu skúmanej membrány. Chemický vzorec spinovej sondy použitej na meranie povrchového potenciálu je znázornený na obr.14.
Obrázok 14 - Chemický vzorec nabitej spinovej sondy.
Ďalšou dôležitou aplikáciou metódy spinovej sondy je meranie pH v mikroobjemoch, napríklad vo vnútri lyzozómov alebo fagozómov buniek. Na tieto účely sa používajú špeciálne pH-senzitívne spinové sondy (obr. 15). Metóda pH-metrie s použitím spinových sond je založená na schopnosti sondy poskytnúť rôzne EPR spektrá v
protonované a deprotonované formy. V závislosti od pK spinovej sondy teda existuje určité rozmedzie pH, v ktorom dochádza k jej protonácii a zodpovedajúcej zmene v EPR spektre (obr. 16).
Obrázok 15 - Chemické vzorce rotačnej sondy citlivej na pH.
Obrázok 16 - EPR spektrá a závislosť koncentrácie deprotonovanej pH-senzitívnej spinovej sondy od pH
Všetko, o čom sa v tejto časti doteraz diskutovalo, bolometóda spinovej sondy. Nie menej zaujímavé však jemetóda spin label. Metóda spin label je založená na rovnakom princípe zmeny EPR spektra nitroxidového radikálu v závislosti od rýchlosti a izotropie jeho rotácie. Rozdielom v metóde je skutočnosť, že spinová značka sa kovalentne viaže na inú viac či menej veľkú
molekula.
Jednou z prvých a úspešných aplikácií metódy spin label bolo meranie množstva a dostupnosti proteínových SH skupín (obr. 17). Chemický vzorec a EPR spektrum spinovej značky interagujúcej so sulfhydrylovými skupinami vo voľnom stave a po naviazaní na proteín sú znázornené na obr.
Obrázok 17 - Schéma interakcie spinovej sondy s tiolovou skupinou proteínu.
Z obrázku je vidieť, že EPR spektrá spinovej značky vo voľnom a viazanom stave sú veľmi odlišné, čo je spôsobené rozdielom v rýchlosti a smere rotácie. Prirodzene, súvisiaci spinový štítok má oveľa nižšiu rýchlosť otáčania ako v voľná forma. Okrem toho je počet priradených spinových značiek a podľa toho aj intenzita EPR signálu úmerné číslu
sulfhydrylové skupiny reagovali so spinovou značkou, čo umožňuje určiť nielen pohyblivosť sondy, ale aj jej množstvo.
Obrázok 18 - Chemický vzorec spinovej značky pre SH-skupiny a EPR spektrá imobilizovanej (1), viazanej (2) a voľnej (3) spinovej značky.
V súčasnosti existuje mnoho metodických techník, ktoré umožňujú študovať topografiu proteínovej globule pomocou spinových značiek. Pretože mnohé kovové ióny s premenlivou mocnosťou sú paramagnetické a navyše sa môžu nachádzať v aktívnom centre enzýmu, interakcia spinovej značky pripojenej napríklad k cysteínovému alebo histidínovému zvyšku proteínovej globule s kovový ión povedie k rozšíreniu spektra EPR v dôsledku paramagnetov interakcie dipól-dipól.
- Metóda spinovej pasce
Objavenie sa nitroxidových radikálov sa ukázalo ako rozhodujúca udalosť pri riešení problému detekcie a štúdia voľných radikálov vytvorených v živých systémoch. Detekcia radikálov bola možná vďaka nástupu tejto metódy
spin pasce. Podstatou metódy je, že nejaká zlúčenina, ktorá nie je nitroxy radikál, ale má štruktúru blízku nitroxy radikálu (spin pasca), interaguje s voľným, krátkodobým radikálom a mení sa na dlhodobý nitroxidový radikál ( spinový adukt ), ktorých EPR spektrum je jedinečné pre daný radikál alebo rodinu radikálov.
Podľa ich chemickej povahy môžu byť spinové pasce klasifikované do dvoch hlavných tried: nitróny a nitrózozlúčeniny. Medzi nitróny patria dva najpopulárnejšie spinové pasce, C-fenyl-N-terc-butylnitrón (PBN) a 5,5-dimetylpyrolín-1-oxyl (DMPO). Reakcia interakcie PBN s radikálom je nasledovná:
Stabilita výsledného nitroxylového radikálu PBN (spinový adukt) sa vysvetľuje tým, že atóm kyslíka, na ktorom je lokalizovaný nepárový elektrón, je priestorovo tienený tromi metylovými skupinami. Spinový adukt radikálu má jedinečné EPR spektrum (pozri obr. 19). Tvar EPR spektier spinových aduktov závisí od povahy pridaného voľného radikálu. Je teda možné vykonávať výskum voľne radikálne reakcie v biologických objektoch metódou EPR pri fyziologických teplotách.
Obrázok 19 - EPR spektrum spinového aduktu a hodnoty hyperjemných deliacich konštánt pre niektoré radikály.
aH a aN hyperjemné deliace konštanty na protónovom a dusíkovom atóme
Obrázok 20 Schéma reakcie zachytávania DMPO a OH radikálu.
Na obr. 20 ukazuje reakciu ďalšieho spinového lapača, DMPO s hydroxylovým radikálom a tvorbu spinového aduktu tohto radikálu. Opäť platí, že meraním hyperjemných deliacich konštánt spektra spinového aduktu je možné identifikovať radikál s krátkou životnosťou.
Metóda spin pasce zaujíma jedno z najdôležitejších miest v biomedicínskom výskume, pretože umožňuje detekovať a identifikovať radikály vznikajúce v živých bunkách a tkanivách. Medzi týmito radikálmi je potrebné uviesť superoxidové a hydroxylové radikály, ako aj oxid dusnatý. Použitie metódy spin trap navyše umožňuje študovať antioxidačné vlastnosti látok a hodnotu antioxidačnej rezervy.
ZÁVER
Metóda elektrónovej paramagnetickej rezonancie (EPR) je založená na interakcii hmoty s magnetickým poľom. Ako už názov metódy napovedá, používa sa na štúdium paramagnetických častíc.
Je známe, že keď sú paramagnety umiestnené v magnetickom poli, paramagnet je vtiahnutý do tohto poľa. Je to spôsobené prítomnosťou magnetických momentov v paramagnetoch Magnetické momenty sú vytvárané nespárovanými elektrónmi.
Príkladmi paramagnetických častíc, ktoré sú zaujímavé pre biológov, sú voľné radikály, ktoré sú medziproduktmi biochemických reakcií, ióny kovov rôznej mocnosti, ako je železo, meď, mangán atď.
Prejav magnetického momentu elektrónu je spôsobený skutočnosťou, že elektrón je nabitá častica a keď sa elektrón otáča okolo svojej osi (pohyb rotácie), pozdĺž osi rotácie sa objaví magnetické pole. Keď je paramagnetická vzorka umiestnená v magnetickom poli, magnetické momenty nepárových elektrónov sú orientované v tomto poli.
poli, rovnako ako sa to deje s magnetickými ihlami.
Magnetický moment nespárovaného elektrónu vo vonkajšom magnetickom poli môže byť orientovaný dvoma spôsobmi - pozdĺž poľa a proti poľu. Ak sa teda v skúmanom systéme nachádzajú nepárové elektróny, aplikácia vonkajšieho magnetického poľa vedie k oddeleniu elektrónov do skupín: magnetické momenty niektorých elektrónov sú orientované pozdĺž poľa, zatiaľ čo iné sú opačné.
ZOZNAM POUŽITÝCH ZDROJOV
- D. Ingramova elektrónová paramagnetická rezonancia v biológii [Text]. Vydavateľstvo "Mir", 1972.
- Voľné radikály v biologických systémoch [Text]. v.1, st.88-175, 178-226. Vydavateľstvo "Mir", 1979.
3. J. Wertz a J. Bolton, Teória a praktické aplikácie metódy EPR [Text], Moskva: Mir, 1975.
4. Moderné metódy biofyzikálny výskum [Text]. Workshop o biofyzike, editoval A.B. Rubina, Moskva: absolventská škola, 1988.
5. Spôsob rotácie štítkov [Text]. Teória a aplikácia, edited L. Berliner, Moskva: Mir, 1979.
6. A.N. Kuznecov, Metóda spinovej sondy, Moskva [Text]: Nauka, 1976.
7. V.E. Zubarev, metóda spinovej pasce, Moskva [Text]: Vydavateľstvo MGU, 1984.
PAGE \* MERGEFORMAT 1
Kapitola 6. Spektroskopia elektrónovej paramagnetickej rezonancie
6.1. Stručné základy metódy
Spektroskopia elektrónovej paramagnetickej rezonancie (EPR) je fenomén rezonančnej absorpcie energie elektromagnetických vĺn paramagnetickými časticami umiestnenými v konštantnom magnetickom poli. K tejto absorpcii dochádza v dôsledku skutočnosti, že nepárové
elektróny paramagnetických častíc sú orientované v konštantnom magnetickom poli tak, že ich vlastný moment hybnosti (spin) smeruje buď pozdĺž poľa, alebo proti poľu. Absorpcia je funkciou nespárovaných elektrónov obsiahnutých v
skúmané |
Kvôli |
prevzatia |
||||
vysokofrekvenčného poľa vzorkou, objaví sa EPR signál. EPR spektrum |
||||||
je závislosť absorpcie mikrovlnnej energie na |
||||||
externé |
magnetické |
Absorpcia pláže |
||||
mikrovlnné magnetické pole sa zaznamenáva buď na obrazovke |
||||||
osciloskopu alebo na záznamníku rádiového spektrometra. |
||||||
ryža. 6.1 je daný |
EPR spektrum |
|||||
hypotetické spojenie.
radikálny. Na tieto účely boli zostavené atlasy EPR spektier rôznych zlúčenín. Nasledujúce parametre čiary sú dôležité pre interpretáciu EPR spektier: tvar, intenzita, poloha a rozdelenie.
Treba poznamenať, že prístroje okamžite dávajú prvú deriváciu krivky absorpcie energie (obr. 6.1).
Intenzita čiary EPR spektra je plocha pod jej krivkou. Je úmerná počtu nespárovaných elektrónov vo vzorke. Poloha čiary v spektre EPR sa považuje za bod, v ktorom je prvá
-0-CH-0-
Ryža. 6.2. Schéma výskytu hyperjemného štiepenia v EPR spektre stredného radikálu polyformaldehydu
keď systém |
obsahuje jadrá s magnetickým momentom, |
||||||
napríklad protón (H1) v blízkosti nepárového elektrónu na magnete |
|||||||
Moment elektrónu je ovplyvnený orientáciou magnetického momentu. jadier |
|||||||
v dôsledku takejto interakcie každá magnetická energia |
|||||||
elektrón |
rozdelí |
SublevelsIt |
|||||
interakcia elektrónu a magnetického jadra sa nazýva hyperjemná |
|||||||
interakcie (STV) a |
rozdeliť |
energie |
úrovne – |
||||
hyperjemné štiepanie (obr. 6.2). |
|||||||
6.2. Aplikácie EPR spektroskopie v |
|||||||
makromolekulárna chémia |
|||||||
EPR spektroskopia |
makromolekulárne |
||||||
sa používa na štúdium voľných radikálov vznikajúcich v nasledujúcich procesoch:
polymerizácia (foto-, radiačná iniciácia atď.);
· degradácia polymérov;
· oxidácia polymérov;
· štiepenie makromolekúl pri mechanickej deštrukcii.
6.3. Štúdium štruktúry radikálov a molekulárnych pohybov
Energia HFI nepárového elektrónu s jadrami pozostáva z dvoch častí – izotropnej a anizotropnej. Izotropná časť teda určuje energiu dipólovej interakcie elektrónu s jadrom a závisí od uhla medzi osou orbitálu nepárového elektrónu a smerom konštantného magnetického poľa. Anizotropný HFI sa prejavuje v EPR spektre radikálov v tuhých látkach, kde je orientácia radikálov pevne fixovaná. Anizotropný HFI v kvapalinách chýba.
polyetylén -CH 2 - CH - CH 2 - CH - (obr. 6.3).
V polykryštalickom polyméri sa spektrum skladá zo šiestich čiar
(obr. 6.3, ale). to |
vzhľadom k tomu, že |
interakcia |
nespárované |
|||
elektrón |
uskutočnené |
|||||
magnetický ekvivalent |
protóny |
konštanty |
||||
O tom istom. |
||||||
Ryža. 6.3. EPR spektrá stredného radikálu polyetylénu v polykryštále (a) a v jedinom kryštáli, keď je os makromolekuly orientovaná pozdĺž poľa (b) a kolmo na pole (c)
Spektrum orientovaného polyetylénu, v ktorom sa cikcak polymérneho reťazca nachádza v smere poľa, má však už päť čiar (obr. 6.3, b). Toto EPR spektrum je spôsobené interakciou nepárového elektrónu iba so štyrmi protónmi. Interakcia s α-vodíkom v tejto orientácii je malá a v spektre sa neprejavuje.
Ak teraz otočíme pole a nasmerujeme ho pozdĺž p-orbitálu, kolmo na cikcak reťazca, potom sa objaví 10 čiar (obr. 6.3, c). Zdvojnásobenie počtu čiar je spôsobené štiepením na α-protóne, ktorý je dostatočne veľký pre túto orientáciu.
Ryža. 6.4. EPR spektrá strednej -CH2-CH-CH2~(a) a koncovej
-CH2-CH2(b) polyetylénové makroradikály
V polyetyléne majú reťazce planárnu konformáciu, a preto je v strednom radikále všetkých päť protónov najbližšie k reakčnému centru radikálu magneticky ekvivalentných. EPR spektrum takéhoto radikálu (obr. 6.4, a) pozostáva zo šiestich čiar, ktorých rozloženie intenzity je opísané binomickým zákonom. EPR spektrum koncového radikálu pozostáva z piatich čiar (obr. 6.4, b).
6.4. Štúdium chemických procesov v polyméroch
Metóda EPR sa používa na detekciu radikálov, štúdium ich premien a radikálových reakcií v polyméroch.
Pre štúdium chemických procesov je dôležité nielen identifikovať radikály, ale aj merať ich koncentrácie. Priame stanovenie voľných radikálov pomocou EPR počas radikálovej polymerizácie nie je v súčasnosti celkom úspešné. Je to spôsobené tým, že pri konvenčných experimentálnych rýchlostiach polymerizácie je koncentrácia radikálov veľmi nízka.
Rastúce makroradikály v kvapalnej a pevnej fáze boli identifikované pomocou EPR, boli stanovené ich koncentrácie a boli nájdené rýchlostné konštanty rastu a ukončenia reťazca.
Základy elektrónovej paramagnetickej rezonancie a jej aplikácia na štúdium voľných radikálov. Nukleárna magnetická rezonancia. Chemický posun. Základy NMR-tomografie.
magnetická rezonancia
Selektívna absorpcia elektromagnetických vĺn určitej frekvencie látkou v konštantnom magnetickom poli v dôsledku preorientovania magnetických momentov jadier sa nazýva tzv. nukleárna magnetická rezonancia.
NMR možno pozorovať, keď je stav ( h = g ja ja AT , kde g ja - nukleárny Lande multiplikátor) len zadarmo atómové jadrá. Experimentálne hodnoty rezonančných frekvencií jadier nachádzajúcich sa v atómoch a molekulách nezodpovedajú stavu. V tomto prípade dochádza k „chemickému posunu“, ku ktorému dochádza v dôsledku vplyvu lokálneho (miestneho) magnetického poľa vytvoreného vo vnútri atómu elektrónovými prúdmi indukovanými vonkajším magnetickým poľom. V dôsledku takéhoto „diamagnetického efektu“ vzniká dodatočné magnetické pole, ktorého indukcia je úmerná indukcii vonkajšieho magnetického poľa, ale v opačnom smere. Preto je celkové efektívne magnetické pole pôsobiace na jadro charakterizované indukciou AT ef = (1 ) AT , kde je skríningová konštanta, rovná sa rádovo 10 -6 a závisí od elektronického prostredia jadier.
Z toho vyplýva, že pre daný typ jadier umiestnených v rôznych prostrediach (rôzne molekuly alebo rôzne neekvivalentné miesta tej istej molekuly) sa rezonancia pozoruje pri rôznych frekvenciách. To je to, čo určuje chemický posun. Závisí to od charakteru chemickej väzby, elektrónovej štruktúry molekúl, koncentrácie danej látky, typu rozpúšťadla, teploty atď.
Ak sú dve alebo viac jadier v molekule skrínované odlišne, t.j. jadrá v molekule zaujímajú chemicky neekvivalentné polohy, potom majú odlišný chemický posun. NMR spektrum takejto molekuly obsahuje toľko rezonančných čiar, koľko je v ňom chemicky neekvivalentných skupín jadier daného typu. Intenzita každej čiary je úmerná počtu jadier v danej skupine.
V NMR spektrách existujú dva typyčiary podľa ich šírky. Spektrá tuhej látkytelá majú veľkú šírku, a toOblasť použitia NMR sa nazýva NMRširoké čiary. V kvapalinách, pozorovanieúzke čiary a toto sa nazýva NMRs vysokým rozlíšením.
Z chemického posunu, počtu a polohy spektrálnych čiar sa dá určiť štruktúra molekúl.
Chemici a biochemici široko používajú metódu NMR na štúdium štruktúry od najjednoduchších molekúl anorganických látok až po najzložitejšie molekuly živých predmetov. Jednou z výhod tejto analýzy je, že neničí predmety štúdia.
Introskopia – vizuálne pozorovanie predmetov alebo procesov vo vnútri optických nepriehľadných telies, v nepriehľadných telesách, v nepriehľadných médiách (látkach).
Výhodou metódy NMR tomografie je jej vysoká citlivosť v obraze mäkkých tkanív, ako aj vysoké rozlíšenie, a to až do zlomkov milimetra. Na rozdiel od röntgenovej tomografie umožňuje NMR tomografia získať obraz skúmaného objektu v ľubovoľnom reze.
magnetická rezonancia- selektívna absorpcia elektromagnetických vĺn látkou umiestnenou v magnetickom poli.
V závislosti od typu častíc - nosičov magnetického momentu - existujú elektrónová paramagnetická rezonancia (EPR) anukleárna magnetická rezonancia (NMR) .
EPR sa vyskytuje v látkach obsahujúcich paramagnetické častice: molekuly, atómy, ióny, radikály, ktoré majú magnetický moment vďaka elektrónom. Výsledný Zeemanov jav sa vysvetľuje štiepením elektronických úrovní. Najbežnejšia EPR na časticiach s čisto spinovým magnetickým momentom .
Otermín absorpcie rezonančnej energie:
Magnetická rezonancia sa pozoruje, ak je častica súčasne ovplyvnená konštantným indukčným poľom AT rez a elektromagnetické pole s frekvenciou . Je možné zistiť rezonančnú absorpciu dve cesty: buď pri konštantnej frekvencii plynule meniť magnetickú indukciu, alebo pri konštantnej magnetickej indukcii plynule meniť frekvenciu. Prvá možnosť je technicky výhodnejšia.
Tvar a intenzita spektrálnych čiar pozorovaných v EPR sú určené interakciou magnetických momentov elektrónov, najmä spinových momentov, medzi sebou navzájom, s mriežkou pevného telesa atď.
Pri elektrónovej paramagnetickej rezonancii spolu s absorpciou energie a nárastom populácie vyšších podúrovní dochádza k opačnému procesu – nežiarivé prechody do nižších podúrovní, energia častice sa prenáša do mriežky.
Proces prenosu energie častíc do mriežky sa nazýva spin-remriežková relaxácia, je charakterizovaná časom .
Moderná technika merania RCS je založená na zisťovaní zmeny ktoréhokoľvek parametra systému, ku ktorej dochádza pri absorpcii elektromagnetickej energie.
Zariadenie používané na tento účel je tzv EPR spektrummeter. Pozostáva z týchto hlavných častí (obr. 25.5): 1 - elektromagnet, ktorý vytvára silné rovnomerné magnetické pole, ktorého indukcia sa môže plynulo meniť; 2 - generátor mikrovlnného žiarenia elektromagnetického poľa; 3 - špeciálna "absorpčná bunka", ktorá sústreďuje dopadajúce mikrovlnné žiarenie na vzorku a umožňuje detekovať absorpciu energie vzorkou (dutinový rezonátor); 4 - elektronický obvod zabezpečujúci pozorovanie alebo záznam EPR spektier; 5 - vzorka; 6 - osciloskop.
Moderné EPR spektrometre používajú frekvenciu okolo 10 GHz
Jednou z biomedicínskych aplikácií EPR je detekcia a štúdium voľných radikálov. EPR sa široko používa na štúdium fotochemických procesov, najmä fotosyntézy. Preskúmajte karcinogénnu aktivitu určitých látok. Na sanitárne a hygienické účely sa na stanovenie koncentrácie radikálov v ovzduší používa metóda EPR.
Získaná metóda EPR veľký význam v chémii, fyzike, biológii, medicíne, pretože umožňuje určiť štruktúru a koncentráciu organických a anorganických voľných radikálov. Voľné radikály môžu vznikať chemicky, fotochemicky alebo vysokoenergetickým žiarením.
EPR spektrum je dané voľnými radikálmi, molekulami s nepárnym počtom elektrónov, tripletovými stavmi organických molekúl, paramagnetickými iónmi prechodných kovov a ich komplexmi.
Metóda EPR sa začala používať v biologickom výskume v 50. rokoch minulého storočia. Pre svoju pomerne vysokú citlivosť a možnosť určenia povahy paramagnetických častíc našla táto metóda široké uplatnenie pri štúdiu množstva biologických procesov.
Okrem signálov voľných radikálov sa v tkanivách pozoruje množstvo kovových signálov (Fe, Cu, Mn, Ni, Co). Tieto kovy sú súčasťou metaloproteínov, ktoré sa podieľajú na množstve enzymatických procesov. Proteíny obsahujúce železo (cytochrómy, ferredoxíny) sú súčasťou elektrónových transportných reťazcov v mitochondriách a chloroplastoch.
Metódou EPR sa študovalo množstvo enzymatických systémov a našli sa produkty voľných radikálov substrátov. V mnohých prípadoch sa ukázalo, že je možné pozorovať redoxné premeny kovových iónov zahrnutých v aktívne centrum enzým.
EPR spektroskopia je široko používaná pri štúdiách fotosyntézy: študuje sa mechanizmus primárnych štádií separácie náboja v reakčných centrách a ďalší prenos elektrónu pozdĺž elektrónového transportného reťazca.
Okrem štúdia mechanizmov reakcií prebiehajúcich za účasti paramagnetických častíc je metóda EPR široko používaná aj na štúdium štrukturálnych a dynamických vlastností makromolekúl a biomembrán.
V poslednej dobe sa na štúdium biologických a polymérnych systémov často používajú metódy „paramagnetickej sondy“, „spin label“ a „spin traps“. Všetky sú založené na použití stabilných radikálov kyseliny dusičnej rôznych štruktúr, resp. na analýze zmien šírky čiary EPR spektier spôsobených rotačnou a translačnou difúziou týchto radikálov.
Hlavnou myšlienkou metódy spinovej značky a sondy je pripojiť voľný radikál k jednej alebo druhej funkčnej skupine proteínu a študovať charakteristiky jeho EPR signálov. Najvhodnejšie sú v tomto ohľade nitroxylové radikály obsahujúce voľnú radikálovú skupinu:
kde R1 a R2 sú rôzne chemické skupiny.
Metóda rotácie štítkov spočíva v tom, že stabilný radikál je pripojený k neparamagnetickej molekule kovalentnou alebo inou väzbou, takže voľná valencia nie je ovplyvnená. Charakter pohybu sa jasne prejavuje vo forme spektra a slúži ako dôležitý zdroj informácií o pôvodnej molekule.
Ak je molekula integrovaná do molekuly proteínu a je tam držaná elektrostatickými silami alebo hydrofóbnymi interakciami, potom sa takáto molekula nazýva otočná sonda. Metóda je založená na štúdiu rotačnej a translačnej mobility radikálu sondy vo vodnom alebo organickom médiu alebo v polymérnej matrici. Pohyblivosť radikálu závisí od pohyblivosti molekúl životné prostredie, preto je radikál akýmsi molekulárnym senzorom štrukturálnych a dynamických informácií o lokálnom prostredí.
Tvar EPR signálu produkovaného spinovou značkou alebo sondou závisí od mikroprostredia nitroxy radikálu a predovšetkým od rotačnej pohyblivosti skupiny, v ktorej je zahrnutý.
Hlavnou nevýhodou spinových značiek a sond je to, že hoci sú tieto molekuly malé, keď sú zahrnuté v lipidovej dvojvrstve, trochu menia jej vlastnosti.
V srdci metódy "točiace pasce" je reakcia neparamagnetickej molekuly (pasce) špeciálne zavedenej do skúmaného systému s krátkotrvajúcim radikálom, ktorej výsledkom je vznik stabilného radikálu. Kinetické správanie výsledného stabilného radikálu a jeho štruktúra poskytujú informácie o kinetike a mechanizme procesov v skúmanom systéme.
Predmetom výskumu v chémii pomocou EPR spektroskopie sú: 1) voľné radikály v medziproduktoch organických reakcií; 2) reakčná kinetika; 3) chémia povrchových javov; 4) zničenie v dôsledku ožiarenia; 5) polymerizácia v dôsledku voľných radikálov; 6) voľné radikály zmrazené pri nízkych teplotách; 7) kovy s premenlivou mocnosťou a ich komplexy.
Metóda EPR predstavuje cenný príspevok k štúdiu kinetiky a mechanizmov chemických reakcií. Po prvé, merania šírky čiary v EPR spektrách môžu byť použité na určenie rýchlostných konštánt procesov zahŕňajúcich paramagnetické častice, ktorých charakteristická životnosť leží v rozsahu 10 -5 -10 -10 s. Po druhé, metóda EPR umožňuje detekovať paramagnetické častice s vysokou citlivosťou za rôznych podmienok, čo poskytuje cenné informácie o reakčných mechanizmoch. Po tretie, EPR spektrometer môže byť použitý ako analytické zariadenie na detekciu koncentrácie reagujúcich paramagnetických molekúl v priebehu reakcií. Počet paramagnetických centier vo vzorke je úmerný ploche pod absorpčným spektrom.
Metóda EPR je široko používaná na štúdium rýchlych procesov spojených so zmenami v molekulárnej štruktúre radikálov. Tieto procesy zahŕňajú bránenú rotáciu a konformačné prechody.
Pre krátkotrvajúce radikály možno citlivosť metódy zvýšiť použitím prietokového systému alebo kontinuálneho ožarovania. EPR spektrá nestabilných radikálov možno získať ich fixáciou v sklách, matriciach zmrazených vzácnych plynov alebo kryštáloch.
Otázky na pohovor
1. Teoretické základy metódy.
2. Analytické parametre EPR spektra.
3. EPR spektrometre.
4. Aplikácia EPR.
Testovacie úlohy
1. Rezonančná podmienka v metóde EPR:
a) n = gHo (1-s) / 2p; b) 5 \u003d (AH / H0); c) hn \u003d gpH0; d) 5 = (Δν/ν 0)/(ΔН/N 0).
2. Čo sa deje v momente rezonancie pri metóde EPR:
a) kvantá žiarenia sú absorbované, nedochádza k reorientácii spinu;
b) absorbujú sa kvantá žiarenia a preorientujú sa spiny, t.j. prechod z nižšieho energetického stavu do vyššieho a naopak. Počet prechodov zdola nahor je väčší ako počet prechodov zhora nadol.
c) absorbujú sa kvantá žiarenia a preorientujú sa spiny, t.j. prechod z nižšieho energetického stavu do vyššieho a naopak. Počet prechodov zhora nadol je väčší ako počet prechodov zdola nahor.
3. Parametre EPR spektier:
a) g-faktor, šírka absorpčného pásma, intenzita absorpčnej čiary;
b) celkový počet signálov, intenzita signálu, chemický posun, multiplicita signálu;
c) g-faktor, šírka absorpčného pásma, intenzita absorpčnej čiary, HFS EPR spektrá.
HMOTNOSŤ SPEKROMETRIA
Táto metóda sa zásadne líši od spektroskopických metód. Metódy hmotnostnej spektrometrie sú založené na ionizácii látky, separácii iónov, podľa pomeru ( m/z) a registráciu hmotnosti vytvorených úlomkov.
Teoretické a experimentálne základy hmotnostnej spektrometrie položil D.D. Thomson, ktorý v roku 1912 prvýkrát vytvoril zariadenie na získanie hmotnostného spektra kladných iónov. Jeho zariadenie však malo nízke rozlíšenie. Jeho študent F. Aston v roku 1918 výrazne zvýšil rozlíšenie a prvýkrát objavil na svojom zariadení izotopy prvkov. Takmer súčasne s F. Astonom v Chicagu skonštruoval A. Dempster prvý hmotnostný spektrometer, v ktorom priečne magnetické pole slúžilo ako analyzátor a iónové prúdy sa merali elektrickými metódami. Jeho schéma sa používa aj v moderných zariadeniach.
Ionizácia molekúl sa musí uskutočňovať za podmienok, za ktorých by vzniknutý ión, bez ohľadu na spôsob ionizácie, nepodliehal žiadnym kolíziám s inými molekulami alebo iónmi. To je potrebné na stanovenie vzťahu medzi vlastnosťami iónu a molekuly.
Ionizačné metódy
Ionizácia sa môže uskutočňovať rôznymi spôsobmi.
1. Metóda ionizácie nárazom elektrónov (EI).
Ide o najbežnejšiu metódu získavania iónov vďaka jednoduchosti a dostupnosti iónových zdrojov a ich vysokej účinnosti. Predpokladajme, že parami látky prechádza prúd elektrónov, ktorých energia sa môže postupne zvyšovať. Ak táto energia dosiahne určitú úroveň, potom keď sa elektrón zrazí s molekulou, elektrón z nej môže byť „vyrazený“ vytvorením molekulárneho iónu:
polyatomická molekula molekulárny ión (radikálový katión)
Najnižšia energia bombardujúcich elektrónov, pri ktorej sa nazýva vznik iónu z danej molekuly ionizačná energia hmoty. Ionizačná energia je mierou sily, s ktorou molekula drží elektrón, ktorý je na ňu najmenej viazaný. Pre organické molekuly je ionizačná energia 9 ÷ 12 eV.
Ak energia elektrónu výrazne prevyšuje ionizačnú energiu, potom výsledný molekulárny ión dostane prebytočnú energiu, ktorá môže byť dostatočná na rozbitie väzieb v ňom. Molekulárny ión sa rozpadá na častice menšej hmotnosti (fragmenty). Takýto proces je tzv fragmentácia . V praxi hmotnostnej spektrometrie sa používajú elektróny s energiou 30÷100 eV, čo zabezpečuje fragmentáciu molekulového iónu.
Molekulárne ióny Sú to ióny, ktorých hmotnosti sa rovnajú hmotnosti ionizovanej molekuly. Bohužiaľ neexistujú žiadne priame metódy na určenie štruktúry iónov. Preto sa často používa predpoklad, že štruktúra molekulového iónu (M +) a neutrálnej molekuly (M) je identická. Pravdepodobnosť vytvorenia molekulárneho iónu je väčšia pre jednoduché, malé molekuly. S nárastom počtu atómov v molekule sa zvyšuje pravdepodobnosť fragmentácie molekulárneho iónu.
Existujú dva hlavné typy fragmentácie molekulárneho iónu - disociácia a preskupenie.
Disociácia- rozpad molekulového iónu so zachovaním sledu väzieb. V dôsledku tohto procesu sa vytvorí katión a radikál:
Disociácia uhľovodíkov vedie k fragmentom s nepárnymi pomermi m/z.
preskupovanie sprevádzaná zmenou poradia väzieb, čo vedie k vytvoreniu nového radikálového katiónu s menšou hmotnosťou a neutrálnej stabilnej molekuly (H 2 O, CO, CO 2 atď.):
Preskupenie uhľovodíkov a zlúčenín obsahujúcich kyslík vedie k fragmentu s rovnomerným pomerom m/z. Meranie hmotnosti výsledných fragmentov a ich relatívneho množstva poskytuje cenné informácie o štruktúre organických zlúčenín.
Uvažujme zariadenie hmotnostného spektrometra (obr. 1). Hmotnostný spektrometer musí obsahovať jednotky na vykonávanie týchto funkcií: 1) ionizácia vzorky, 2) zrýchlenie iónov elektrickým poľom, 3) rozdelenie iónov podľa pomeru m/z, 4) detekcia iónov zodpovedajúcim elektrickým signálom. .
Obr.1. Zariadenie hmotnostného spektrometra
1 - zdroj elektrónov; 2 - ionizačná komora; 3 - urýchľovacie platne (negatívny potenciál); 4 - magnet; 5 - štrbina;
6 - iónový kolektor (iónový detektor)
Aby sa získalo hmotnostné spektrum, pary látok sa v malých množstvách zavádzajú do ionizačnej komory pomocou špeciálneho nafukovacieho systému. (2) , kde je udržiavané hlboké vákuum (tlak 10 -6 mm Hg). Molekuly látky sú bombardované prúdom elektrónov emitovaných horúcou katódou (1). Výsledné ióny sú vytlačené z ionizačnej komory malým rozdielom potenciálov (3). Výsledný tok iónov je zrýchlený, zaostrený silným elektrickým poľom a vstupuje do magnetického poľa. (4).
V dôsledku bombardovania molekúl hmoty elektrónmi vznikajú častice, ktoré majú kladný alebo záporný náboj, ako aj neutrálne častice. Keď prúd častíc prechádza magnetickým poľom, neutrálne častice nemenia smer, zatiaľ čo kladné a záporné častice sú vychyľované rôznymi smermi. Vychýlenie iónov je úmerné ich náboju a nepriamo úmerné ich hmotnosti.
Každý jednotlivý ión, charakterizovaný špecifickou hodnotou m/z, sa pohybuje po svojej vlastnej trajektórii pre danú intenzitu magnetického poľa. Interval snímania hmoty možno meniť zmenou intenzity magnetického poľa alebo potenciálu elektrického poľa.
V konvenčnej hmotnostnej spektrometrii je zvykom registrovať len častice, ktoré majú kladný náboj, pretože. keď sú molekuly bombardované elektrónmi, zvyčajne je viac kladne nabitých iónov ako záporne nabitých iónov. Ak je potrebné študovať negatívne nabité ióny, malo by sa zmeniť znamienko akceleračného potenciálu (urýchľovacie platne).
Ak je na výstupe iónov z magnetického poľa nainštalované záznamové zariadenie, častice líšiace sa hodnotami m/z vydajú samostatné signály. Intenzita signálu bude úmerná počtu častíc s danou hodnotou m/z. Intenzita signálov je definovaná ako ich výška vyjadrená v mm. Výška píku s maximálnou intenzitou sa berie ako 100 % (základný pík), intenzita zostávajúcich píkov sa proporcionálne prepočíta a vyjadrí v percentách.
So zvyšovaním pomeru m/z sa zmenšuje rozdiel vo výchylke magnetickým poľom častíc, ktoré sa líšia o jednu jednotku atómovej hmotnosti. V tomto ohľade je dôležitou charakteristikou hmotnostných spektrometrov ich rozlíšenie (R) , ktorý určuje maximálnu hmotnosť iónov, ktoré sa líšia o jednu jednotku atómovej hmotnosti (pri ktorých prístroj oddeľuje píky aspoň o 90 %):
kde M je maximálna hmotnosť, pri ktorej je prekrytie vrcholu menšie ako 10 %; ΔM je jedna atómová hmotnostná jednotka.
Štandardné zariadenia majú R ≈ 5000/1 a pre zariadenia s dvojitým zaostrovaním toku iónov R ≈ 10000/1 a ešte viac. Takéto zariadenia sú schopné zachytiť rozdiel v molekulovej hmotnosti iónov až do 0,0001. Hmotnostný spektrometer s dvojitou fokusáciou môže ľahko oddeliť píky iónov s rovnakými nominálnymi molekulovými hmotnosťami, ale odlišným elementárnym zložením. Napríklad môže rozlišovať medzi N2 (28,0061), CO (27,9949) a C2H4 (28,0313).
Vytvorenie empirického vzorca z údajov o hmotnostnom spektre nie je jednoduchá úloha, ale dá sa vyriešiť pomocou vhodného algoritmu. Na získanie hmotnostného spektra je potrebné zanedbateľné množstvo látky - asi 1 μg.
2. Chemická ionizácia (CI).
Pri tejto metóde sa vzorka pred ožiarením elektrónovým lúčom zriedi veľkým prebytkom "reagenčného plynu". Pravdepodobnosť primárnych ionizačných zrážok medzi elektrónmi a molekulami vzorky je potom taká malá, že primárne ióny sa tvoria takmer výlučne z molekúl reaktantov. Ako činidlá, plyny s nízkou molekulová hmotnosť napríklad CH4, izo-C4H10, NH3 a inertné plyny (Ar, He). Sekundárne ióny vznikajú v dôsledku prenosu atómu vodíka alebo elektrónu.
Ak je reaktantom metán, reakcie prebiehajú v nasledujúcom poradí:
CH 4 + ē → CH 4 + + 2 ē
CH 4 + + ē → CH 3 + + H + + 2 ē
CH 4 + + CH4 → CH5 + +CH3
CH 3 + + CH4 -> C2H5 + +H2
R-CH3 + CH5 + → R-CH 4 + +CH4
kde R-CH3 je molekula testovanej látky.
Štúdie ukázali, že častice CH 5 + a C2H5 + spolu tvoria asi 90 % iónov prítomných v tomto systéme. Hmotnostné spektrá získané po chemickej ionizácii sú oveľa jednoduchšie, obsahujú menej píkov, a preto sa často ľahšie interpretujú.
ELEKTRONICKÁ PARAMAGNETICKÁ REZONANCIA (EPR)- rezonančná absorpcia elektromagnetických vĺn látkami obsahujúcimi paramagnetické častice. Metódy založené na EPR našli široké uplatnenie v laboratórnej praxi. S ich pomocou študujú kinetiku chemických a biochemických reakcií (pozri Kinetika biologických procesov, Chemická kinetika), úlohu voľných radikálov v životne dôležitých procesoch organizmu za normálnych a patologických stavov (pozri Voľné radikály), mechanizmy vzniku výskyt a tok fotobiologických procesov (pozri Fotobiológia) atď.
Fenomén EPR objavil sovietsky vedec B.K. Zavoisky v roku 1944. Elektrónová paramagnetická rezonancia je charakteristická len pre paramagnetické častice, to znamená častice schopné magnetizácie, keď na ne pôsobí magnetické pole) s nekompenzovaným elektronickým magnetickým momentom, ktorý je zase spôsobený vlastným mechanickým momentom elektrónu - spinom. Elektróny majú zvláštny druh vnútorného pohybu, ktorý možno prirovnať k rotácii vrcholu okolo jeho osi. Súvisiaci moment hybnosti sa nazýva spin. V dôsledku spinu má elektrón permanentný magnetický moment nasmerovaný proti spinu. Vo väčšine molekúl sú elektróny usporiadané v orbitáloch tak, že ich spiny smerujú opačne, magnetické momenty sú kompenzované a signál EPR z nich nie je možné pozorovať. Ak magnetické pole elektrónu nie je kompenzované spinom iného elektrónu (to znamená, že molekula obsahuje nepárové elektróny), potom sa zaznamená signál EPR. Častice s nepárovými elektrónmi sú voľné radikály, ióny mnohých kovov (železo, meď, mangán, kobalt, nikel atď.), množstvo voľných atómov (vodík, dusík, alkalické kovy atď.).
Pri absencii vonkajšieho magnetického poľa môže byť smer (orientácia) magnetického momentu elektrónu v priestore ľubovoľný; energia takéhoto elektrónu nezávisí od orientácie jeho magnetického momentu. V súlade so zákonmi kvantovej mechaniky vo vonkajšom magnetickom poli nemôže byť orientácia magnetického momentu elektrónu ľubovoľná - môže byť nasmerovaná buď v smere magnetického poľa, alebo naopak.
V súlade s orientáciou magnetického momentu elektrónu môže jeho energia v magnetickom poli nadobudnúť tiež iba dve hodnoty: minimálnu E1 - keď je magnetický moment orientovaný "pozdĺž poľa" a maximálnu E2 - keď je orientovaný "proti poľu" a rozdiel energií týchto stavov (delta E ) vypočítame podľa vzorca: ΔE = gβH, kde β je Bohrov magnetón (jednotka merania magnetického momentu elektrónu), H je sila magnetického poľa g je konštanta v závislosti od elektrónovej štruktúry paramagnetickej častice. Ak na systém nepárových elektrónov vo vonkajšom magnetickom poli pôsobí elektromagnetické žiarenie, ktorého kvantová energia sa rovná ΔE, potom vplyvom žiarenia začnú elektróny prechádzať zo stavu s nižšou energiou do stavu s vyššou energiou, ktorá bude sprevádzaná absorpciou žiarenia látkou.
EPR sa označuje ako metódy rádiovej spektroskopie, pretože na pozorovanie elektrónovej paramagnetickej rezonancie sa používa žiarenie v oblasti rádiovej frekvencie elektromagnetických vĺn.
EPR sa zaznamenáva pomocou špeciálnych prístrojov - rádiových spektrometrov. Zahŕňajú: elektromagnet, zdroj rádiofrekvenčného žiarenia, vedenie prenosu žiarenia od zdroja k vzorke (vlnovod), rezonátor, v ktorom sa nachádza skúmaná vzorka, systémy na detekciu, zosilnenie a záznam signálu. Najbežnejšie rádiové spektrometre, ktoré využívajú elektromagnetické žiarenie s vlnovými dĺžkami 3,2 cm alebo 8 mm.
Registrácia signálu EPR sa vykonáva nasledovne. Intenzita magnetického poľa vytvoreného elektromagnetom sa v určitých medziach lineárne mení. Pri hodnotách napätia zodpovedajúcich stavu rezonancie vzorka absorbuje energiu elektromagnetického žiarenia. Absorpčná čiara (signál EPR) je závislosť výkonu žiarenia absorbovaného vzorkou od intenzity magnetického poľa. V existujúcich rádiových spektrometroch sa EPR signál zaznamenáva ako prvá derivácia absorpčnej čiary.
Na popis a analýzu EPR spektier sa používa množstvo parametrov charakterizujúcich intenzitu čiar, ich šírku, tvar a polohu v magnetickom poli. Intenzita čiar EPR, ak sú ostatné veci rovnaké, je úmerná koncentrácii paramagnetických častíc, čo umožňuje vykonať kvantitatívnu analýzu.
Pri zvažovaní javu EPR je potrebné vziať do úvahy, že magnetický moment nepárového elektrónu interaguje nielen s magnetickým poľom elektromagnetu, ale aj s magnetické polia vytvorené prostredím elektrónu: iné nepárové elektróny, magnetické jadrá (pozri Nukleárna magnetická rezonancia). Interakcia nepárových elektrónov s jadrami často vedie k rozdeleniu spektra EPR na množstvo čiar. Analýza takýchto spektier umožňuje identifikovať povahu paramagnetických častíc a vyhodnotiť povahu a stupeň ich vzájomnej interakcie.
Účasť paramagnetických častíc na chemických reakciách, molekulárnom pohybe a iných kinetických efektoch tiež ovplyvňuje tvar EPR spektra. Preto sa EPR používa na detekciu, kvantifikáciu a identifikáciu paramagnetických častíc, štúdium kinetiky chemických a biochemických reakcií a molekulárnej dynamiky.
Vďaka svojej všestrannosti je EPR široko používaný v rôznych oblastiach vedy. Využitie EPR v biológii a medicíne je spôsobené prítomnosťou v bunkách, tkanivách a biol. kvapaliny rôznych paramagnetických centier v prírode. Pomocou EPR bola zistená prítomnosť voľných radikálov takmer vo všetkých živočíšnych a rastlinných tkanivách. Zdrojom voľných radikálov sú zlúčeniny ako flavíny, koenzým Q a ďalšie látky, ktoré pôsobia ako nosiče elektrónov pri reakciách energetického metabolizmu v rastlinných a živočíšnych bunkách; paramagnetické centrá nachádzajúce sa v izolovaných tkanivách patria najmä do elektrónových transportných reťazcov mitochondrií, mikrozómov, chloroplastov (pozri Dýchanie). Zistilo sa, že obsah voľných radikálov v tkanivách koreluje s ich metabolickou aktivitou. Početné práce ukazujú zmenu počtu voľných radikálov pri rôznych patologických stavoch, napríklad počas onkogenézy (pozri), rozvoj radiačného poškodenia (pozri), toxikózu (pozri Intoxikácia), čo sa vysvetľuje porušením energetického metabolizmu v patológia (pozri Bioenergetika).
Pomocou EPR v tkanivách živočíchov a rastlín sa stanovujú paramagnetické ióny (železo, meď, mangán, kobalt atď.), ktoré sú súčasťou metaloproteínov zapojených do reakcií prenosu elektrónov pozdĺž elektrónových transportných reťazcov a enzymatickej katalýzy. ako v pigmentoch prenášajúcich kyslík (hemoglobín). Pomocou EPR je možné študovať redoxné premeny kovových iónov a povahu interakcie iónov s ich prostredím, čo umožňuje stanoviť jemnú štruktúru komplexov obsahujúcich kov.
Patologické zmeny v tkanivách vedú k zmenám EPR signálov metaloproteínov, čo je spojené s rozpadom komplexov paramagnetických kovov, zmenami prostredia paramagnetických iónov a prechodom iónov na iné komplexy. Štúdium povahy paramagnetických centier tkanív, najmä voľných radikálov, je však spojené s určitými ťažkosťami v dôsledku zložitosti dešifrovania EPR spektier.
Pomocou EPR bolo možné skúmať mechanizmy enzymatických reakcií (pozri Enzýmy). Predovšetkým je možné súčasne študovať ako kinetiku tvorby a spotreby voľných radikálov v priebehu enzymatických reakcií, tak kinetiku redoxných premien kovov, ktoré sú súčasťou enzýmov, čo umožňuje stanoviť postupnosť fáz. enzymatickej reakcie.
Využitie EPR pri štúdiu radiačného poškodenia v biol. objektov umožňuje získať informácie o povahe radikálov vznikajúcich v biopolyméroch, o mechanizmoch a kinetike radikálových reakcií, ktoré vznikajú v ožiarených objektoch a vedú k biologickému účinku. Metódu EPR je možné využiť v havarijnej dozimetrii, napríklad pri náhodnom ožiarení ľudí na posúdenie dávky žiarenia, pričom sa na to používajú predmety z radiačnej zóny.
Dôležité miesto má EPR pri štúdiu fotobiologických procesov s voľnými radikálmi (pozri Molekula, Voľné radikály, Fotobiológia, Fotosenzibilizácia). EPR sa používa na podrobné štúdium procesov tvorby voľných radikálov v proteínoch, nukleových kyselinách a ich zložkách pôsobením ultrafialové žiarenieúlohu týchto radikálov pri fotodegradácii biopolymérov (pozri Svetlo). Použitie EPR dalo dôležitá informácia o primárnych mechanizmoch fotosyntézy (pozri). Ukázalo sa, že primárnou reakciou fotosyntézy je prenos elektrónu z molekuly chlorofylu excitovaného svetlom a vznik katiónu chlorofylového radikálu. Bola tiež identifikovaná povaha molekúl, ktoré prijímajú elektrón darovaný excitovanou molekulou chlorofylu.
EPR sa používa aj na štúdium štruktúry biologicky dôležitých makromolekúl a biomembrán. Napríklad ióny železa, ktoré sú súčasťou hemu v proteínoch obsahujúcich hem, môžu byť v stave s vysokým spinom (elektróny na vonkajších dráhach nie sú spárované, celkový spin je maximálny) a s nízkym spinom (vonkajšie elektróny sú úplne alebo čiastočne spárované). , rotácia je minimálna). Štúdie znakov EPR signálov vysokospinových a nízkospinových stavov iónov železa v hemoglobíne a jeho derivátoch prispeli k pochopeniu priestorovej štruktúry molekuly hemoglobínu.
Významný pokrok v štúdiu štruktúry biomembrán a biopolymérov sa dosiahol po nástupe metód spinovej sondy a značenia (pozri Biologické membrány). Ako spinové značky a sondy sa používajú hlavne stabilné nitroxidové radikály (pozri Voľné radikály). Nitroxylový radikál môže byť kovalentne naviazaný na molekuly (spin label) alebo zadržaný v skúmanom systéme v dôsledku fyzikálnych interakcií (spin sonda). Podstata spočíva v tom, že tvar EPR spektra nitroxidových radikálov závisí od vlastností mikroprostredia: viskozita, charakter a pohyb molekúl, lokálne magnetické polia atď. Spinové značky kovalentne viazané na rôzne skupiny biopolymérov sú indikátorom tzv. stav biopolymérnej štruktúry. Pomocou spinových značiek sa študuje priestorová štruktúra biopolymérov, štrukturálne zmeny proteínov pri denaturácii, tvorba komplexov enzým-substrát, antigén-protilátka atď.
Metóda spinových sond sa používa na štúdium spôsobov balenia a mobility lipidov v biomembránach, interakcie lipid-proteín, štrukturálne prechody v membránach spôsobené pôsobením rôzne látky atď. Na základe štúdia spinových značiek a sond, metód na stanovenie lieky v biol. tekutín, ako aj problematika riadenej prepravy drog a pod.
S pomocou EPR sa teda v norme a v prípade akejkoľvek patológie zobrazuje široká distribúcia elektronických procesov v tele. Vytvorenie teórie a zdokonalenie techniky metódy EPR tvorilo základ kvantovej elektroniky ako vedného odboru, viedlo k vytvoreniu molekulárnych generátorov a zosilňovačov rádiových vĺn (maserov) a svetla - laserov (pozri), ktoré sú široko používané v mnohých oblastiach národného hospodárstva.
Blumenfeld L. A., Voevodsky V. V. a Semenov A. G. Aplikácia elektrónovej paramagnetickej rezonancie v chémii, Novosibirsk, 1962, bibliografia; Wertz J. a Bolton J. Teória a praktické aplikácie metódy EPR, prekl. z angl. M., 1975, bibliogr.; Ingram D. Elektrónová paramagnetická rezonancia v biológii, trans. z angličtiny M., 1972; Kalmanson A. E. Aplikácia metódy elektrónovej paramagnetickej rezonancie v biochémii, v knihe: Usp. biol. chem., ed. B. N. Stepanenko, zväzok 5, s. 289, M., 1963; Metóda sondy Kuznetsov A. N. Spin. M., 1976; Lichtenštajnsko G. I. Metóda spinových značiek v molekulárnej biológii, M., 1974; The Spin Label Method, ed. L. Berliner, prekl. z angličtiny, M., 1979; Voľné radikály v biológii, ed. W. Pryor, prekl. z angličtiny, zväzok 1, s. 88, 178, M., 1979.
K. N. Timofejev.